細胞工程-第六章-胚胎工程課件

第六章胚胎工程曹君邁6.1胚胎工程胚胎工程（embryoengineering）是指所有對配子和胚胎進行人為地干預(yù)，使其環(huán)境因素、發(fā)育模式或局部組織功能，發(fā)生量和質(zhì)的變化的綜合技術(shù)。

胚胎工程的歷史：1891年，英國劍橋大學(xué)的希普就在兔子身上首次成功地進行了受精卵的移植實驗。20世紀(jì)30年代，一些學(xué)者相繼在鼠、兔、綿羊、山羊、豬、牛和馬等動物進行胚胎移植試驗，獲得成功。胚胎工程的意義：(一)發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力(二)促進家畜改良的速度(三)作為胚胎操作的基礎(chǔ)(四)保存遺傳資源6.2胚胎工程的技術(shù)方法6.21人工受精6.22胚胎移植6.23胚胎分割6.24胚胎融合6.25動物性別與胚胎性別鑒定6.26胚胎冷凍保存技術(shù)

6.21人工受精1.精子2.卵母細胞3.體外受精1精子1)精子的獲得：精液的采取方法通常有：人工陰道法、電刺激法、陰道內(nèi)回收法等。對于個體較大的動物多采用人工陰道法，而對于小動物而言多采用電刺激法采精。3)精液的保存精液的保存可以分為常溫（15－25℃）、低溫（0－5℃）和超低溫冷凍（－79℃－-196℃）三種，其目的是要降低精子的代謝活動，延長其存活時間，盡量保存其受精能力。保存前，要加稀釋液，其成分按其作用可分為稀釋劑、營養(yǎng)劑和保護劑等。稀釋劑包括等滲氯化鈉溶液和某些鹽溶液，營養(yǎng)劑包括糖類、奶類和卵黃等，保護劑包括有抗凍作用的營養(yǎng)劑和其它一些如甘油、DMSO、糖類等。三種保存方法常溫保存主要通過降低pH值達到抑制精子的代謝活動，一般可以保存2天以上。低溫保存主要是抑制其正常的代謝活動，除豬外，其它家畜的保存效果均較好。如果應(yīng)用超低溫可以在液氮中長期保存精液，用時可以即時解凍。對于不同的動物，各種保存液的配制方法都有所差異的。2采卵1)輸卵管內(nèi)采卵：以鼠為例，一般為了防止干燥可將屠殺后取出的輸卵管放在平皿內(nèi)，用石蠟油覆蓋，在實體顯微鏡下找到輸卵管膨大不，用磨尖的鐘表鑷子，切開輸卵管膨大部，使內(nèi)容物溢出而找到卵。2)對于稍大一些的動物可以用活體輸卵管采卵，例如將兔子的腹部正中線切開，找出子宮角和輸卵管。然后利用逆向沖卵法，自子宮輸卵管連接處插入注射針，傘部以平皿接著沖洗；或在子宮輸卵管連接處下1cm處，剪成V形小口，插入塑料細管，自傘部輸卵管腹腔口插入，將液體推入，得到?jīng)_出的卵。2采卵3)對于屠宰場中的大中型動物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手術(shù)后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。4)對人而言通常在超數(shù)排卵步驟處理后，用B超檢測卵巢表面卵泡發(fā)育情況，然后，在腹腔后部體壁進行局部麻醉，將腹腔鏡望遠鏡插管插入，以觀察卵巢表面卵泡成熟情況，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵針將卵吸出，放平皿中檢查。3體外受精體外受精（invitrofertilization，IVF）就是將哺乳動物卵母細胞從母體取出，在體外進行精卵結(jié)合的過程。主要包括：成熟或未成熟的卵母細胞獲得、體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立、處理附睪內(nèi)和射出精子、使精卵結(jié)合——受精、受精卵的體內(nèi)或體外培養(yǎng)（invitroculture，IVC）、移植妊娠和產(chǎn)仔由于體外受精在實驗室進行，所以得到的動物或人稱為“試管動物”或“試管嬰兒”。歷史1951年Chang和Austin發(fā)現(xiàn)了精子的獲能現(xiàn)象，為體外受精的實現(xiàn)打開了通路。1954年，Thibault等獲得第一只體外受精的兔子。隨著研究深入，試管老鼠、試管豬、試管牛等相繼產(chǎn)生。1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“試管嬰兒”，至此，體外受精技術(shù)逐漸成熟。過程獲得獲能的精子和成熟的卵母細胞后，應(yīng)在塑料平皿底部，用已經(jīng)處理獲能的精子浮游液5μl精子浮游液，注入小滴中，將成熟培養(yǎng)后的卵母細胞，或自體內(nèi)手術(shù)沖出的卵母細胞，以BO液沖洗，用微吸管吸10個卵母細胞與少量BO液注入精子浮游液小滴中。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7小時后再經(jīng)微量吸管自小滴中用BO液多次沖洗以洗去多余的精子。然后移入發(fā)育培養(yǎng)液（TCM－199＋10％FCS）繼續(xù)培養(yǎng)。顯微操作協(xié)助受精在顯微操作儀下進行顯微受精，即對哺乳動物的精子和卵母細胞，進行顯微操作，促使其相互結(jié)合技術(shù)，這可以解除透明帶和質(zhì)膜對精子的阻擋作用。1976年，Uehara和Yanagimachi將倉鼠或人的精子在顯微操作儀下，通過顯微工具，注射到倉鼠卵母細胞的細胞質(zhì)中，使精子核在卵胞質(zhì)中染色體解螺旋形成了原核。隨后，又深入研究了操作技術(shù)，分成了卵胞質(zhì)內(nèi)精子注射、透明帶下注射、透明帶鉆孔和透明帶部分切口等幾種。其它一些方法如果在透明帶上人為鉆孔后，可以為精子入卵提供機會，或者是易于精子入卵?？梢韵扔霉潭ㄎ芄潭ㄗ÷?，然后將吸滿酸性臺氏液（pH2.5）的微吸管沿卵外周切線方向往透明帶上射出穩(wěn)定的液流。當(dāng)透明帶上溶出小孔后，即可撤走注射針。將卵洗滌后，再用適當(dāng)密度的精子進行受精。先用胰麋蛋白酶軟化透明帶，然后用纖細的針在透明帶上扎針孔，本法適用于精子運動乏力或少精癥不育患者的治療。通過該技術(shù)已經(jīng)使得小鼠獲得了超過30％的妊娠或出生率，而且并沒有增加孤雌活化率和多精受精率。另外，可以用微細玻璃針或金屬微刀片，在透明帶上切開或挑開或撕開一個口，再經(jīng)適當(dāng)濃度精子受精。4）精卵融合過程A頂體反應(yīng)后，精子穿過透明帶進入卵周隙B以赤道段與卵質(zhì)膜相融合C融合后CGs胞吐，核開始去致密D精子頭部完全入卵，將一部分卵質(zhì)膜帶入。體外受精的意義可以用來研究受精機理，治療人類男性和動物的生殖不育，可以利用體外受精卵的發(fā)育狀況或染色體核型檢測用來檢測形態(tài)不正常精子其染色體是否正常，可以產(chǎn)生大量的轉(zhuǎn)基因動物，還可以簡化煩雜的凍精技術(shù)，或許只保存核物質(zhì)，就可以達到受精的目的，這對保護珍貴的動物資源，將起到重要的作用。體外受精技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜產(chǎn)學(xué)、實驗動物學(xué)等各個領(lǐng)域。6.22胚胎移植胚胎移植（embryotransfer，ET）一般是針對早期胚胎而言，它是指附植前的早期胚胎很容易由子宮中取出，經(jīng)過人為處理，可以再送入子宮的過程，這是胚胎生物工程的基本技術(shù)。1)超數(shù)排卵如果一次要獲得多個卵，可以利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個過程就稱為超數(shù)排卵（superovulation）

如在小鼠Ⅳ－Ⅴ期涂片相時注射5－10IUPMSG，48－50小時后，再于皮下或腹腔注射5－10IUhCG，這種方法可以獲得超數(shù)排卵。人的人工采卵和超數(shù)排卵，要在月經(jīng)期5－9天，每天給予100－150mg克羅米酚，11天或12天用B型超聲檢測卵巢表面的卵泡直徑達到20mm時，再給予4000－9000IUhCG，32－40小時后取卵。2)同期發(fā)情胚胎移植時，供體胚胎必須與受體子宮內(nèi)膜發(fā)育狀態(tài)高度同步化，才能獲得好效果，這個過程稱為同期發(fā)情（oestrusynchronization），包括自然同期發(fā)情和人工同期發(fā)情。自然同期發(fā)情即不經(jīng)任何藥物處理，依靠動物自身的性周期規(guī)律，選擇處于適當(dāng)時期的母畜作為受體。實際操作中，多用性激素進行人工同期發(fā)情。以小鼠為例，將自然排卵或人工超排的小鼠與結(jié)扎輸精管的公鼠交配，造成假孕。子宮移植時，一般選用假孕2.5天的母鼠。3)胚胎收集胚胎培養(yǎng)之前，先從動物子宮內(nèi)將胚胎收集不同的動物其收集方法是不一樣的。以小鼠為例，一般用頸部脫臼法殺死小鼠，開腹取出子宮和輸卵管并將其各部分離，分別放于37℃生理鹽水或M2＋BSA中，在實體顯微鏡下，用尖鐘表鑷子撕開輸卵管，可以見到受精卵或卵裂胚胎，亦可以沖洗法將胚胎沖到平皿中。如沖洗囊胚，可用注射器針頭自子宮角的輸卵管端插入，推入0.2－0.5mlM2＋BSA液，將胚胎沖到平皿中。對于像牛等大型動物而言，如果要取受精卵或早期卵裂胚，應(yīng)用手術(shù)方法沖洗輸卵管或?qū)⑴⑺廊〕鲚斅压軟_洗之。但6天后的胚胎，已經(jīng)移行到子宮角前部，可以用非手術(shù)的方法取之。4)胚胎移植移植分為手術(shù)移植和非手術(shù)移植，在無菌條件下，向輸卵管或子宮內(nèi)用微吸管將吸入的胚胎注入，在小鼠、大鼠和倉鼠都應(yīng)在動物背部開口，找出輸卵管將胚胎移入向子宮內(nèi)移植多在囊胚期，成功率較高，在小鼠和大鼠，可達到70％－80％。羊和豬一般是開腹進行手術(shù)移植，在牛，目前多進行非手術(shù)移植，但只適用于晚期胚胎(5日齡的牛胚胎)不適用于體形較小的動物。(1)手術(shù)法移植手術(shù)法是指將動物固定、全身麻醉或局部麻醉后，清理手術(shù)部位。在背部或腹中線開口，將輸卵管或子宮拉出體外。如果進行輸卵管移植，把吸好胚胎的移植管由輸卵管傘口插入管內(nèi)，盡量插得深一些。然后把胚胎吹入輸卵管內(nèi)。移植時，應(yīng)盡量少帶入液體。如果進行子宮移植，在離子宮角與輸卵管接合部約5cm處，先用鈍頭針扎一小孔，隨即抽出，把移植管順此孔插入子宮腔，吹入胚胎。復(fù)位、縫合。手術(shù)法一般是移植卵裂早期的胚胎。(2)非手術(shù)法移植-牛用人工受精管，通過子宮頸進入子宮體，然后注入胚胎，但只適用于晚期胚胎(5日齡的牛胚胎)。不適用于體形較小的動物。6.23胚胎分割同卵雙生胚胎分割的原理根據(jù)卵裂球具有發(fā)育成為一個個體的全能性的特點，人們就考慮用這種實驗技術(shù)，生產(chǎn)同卵雙胎或多胎，以加速優(yōu)良種群的繁殖。胚胎的分割在不同時期有不同的分離培養(yǎng)方法，如卵裂球分離培養(yǎng)法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。過程把經(jīng)過軟化處理的胚胎，與少量培養(yǎng)液一起置于載片上，把針或微刀的刃部調(diào)節(jié)到胚胎的正上方。然后自胚胎的等分線向下移動，把胚胎輕輕壓住，繼續(xù)下切，胚胎就被壓扁，繼而被切開。再把切割的胚胎納入空透明帶。囊胚切割時，需將內(nèi)細胞團一分為二，早期的囊胚的二分胚發(fā)育率，比桑椹胚的二分胚發(fā)育率要低，可能是因為囊胚正處于進一步的細胞分化狀態(tài)，操作后胚胎的調(diào)整能力比桑椹胚差。相對而言，二分胚、四分胚比較容易培養(yǎng)，而八分胚的存活率很低。過程胚胎分割6.24胚胎嵌合(胚胎融合)嵌合體（chimera）是指在同一個體中，由于基因型不同的細胞或組織互相接觸，且各自獨自并存的狀態(tài)發(fā)育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合體稱為原發(fā)性嵌合體，而把在發(fā)育的較晚期，如胚層已經(jīng)分化，或器官開始形成后，通過組織移植或嫁接等方法所形成的部分組織或器官的嵌合，稱為次生性嵌合體1901年，Spemann最早開始進行動物嵌合體的研究，他進行了蛙嵌合個體的培育，其目的是為了研究兩棲類動物的發(fā)育機制。1960年，Mintz開始研究嵌合體制作技術(shù)，到1965年第一次獲得活至成體的正常小鼠嵌合體。植入前胚胎嵌合體的制作方法1)聚合法第一種可以利用胚胎與胚胎聚合，即使用發(fā)生致密化后的胚胎，用酸性臺氏液（pH2.5）或0.5％鏈霉蛋白酶除去透明帶，充分洗滌后，放入含有5μg/ml植物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。讓一個胚胎垂直位于另一胚胎之上，借機械壓力和PHA的作用，更易聚合。若放到37℃時，效果更佳，聚合完畢后，洗除PHA，繼續(xù)培養(yǎng)，或進行胚胎移植。第二種是利用卵裂球或細胞與胚胎聚合，將胚胎卵裂球解離或用其他游離的細胞，與胚胎聚合。當(dāng)用一個已經(jīng)除去透明帶的胚胎時，將卵裂球或細胞在胚胎的正上方慢慢釋放，使兩者直接接觸，借助PHA的作用使之聚合。當(dāng)用兩個無透明帶胚胎時，以類似“三明治”的方式，把細胞放到兩個胚胎之間，使之聚合。第三種利用兩種細胞間聚合。聚合時，各取數(shù)個細胞或卵裂球，放入空透明帶內(nèi)，用PHA使之聚合在一起，并用瓊脂包埋。通過中間受體培養(yǎng)一段時間后，觀察其發(fā)育的情況。2)囊胚注射法囊胚注射法是把某些種類細胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的細胞可以是卵裂球、內(nèi)細胞團細胞、胚胎干細胞，甚至是已經(jīng)分化的細胞。若注入的細胞并入內(nèi)細胞團并參與胚體的形成，那么就形成了嵌合體。注射時，選取健康、生長良好的細胞。如果是培養(yǎng)細胞，應(yīng)該保證其整二倍體性。將10－12個細胞吸入到注射吸管的頂端。用固定吸管吸住內(nèi)細胞團與滋胚層交界處，讓內(nèi)細胞團位于囊胚的底部位置。調(diào)整注射吸管與固定吸管使處于同一焦點平面，選擇滋胚層細胞間的“間隙處”，將注射吸管插入囊胚腔。將細胞推入囊胚腔，使之落到內(nèi)細胞團之上。操作后的囊胚形態(tài)不規(guī)則，經(jīng)短期培養(yǎng)后，可以恢復(fù)正常狀態(tài)。制作過程小鼠嵌合體的制作過程分析是否是嵌合體及嵌合的程度兩種：色素分析法和遺傳分析法色素分析法簡單、直觀，比較實用。一般選用膚色、毛色差異明顯的動物的胚胎作為供體胚，如用白鼠或黑鼠。幼鼠生下4－5天后，就可以分析其膚色或毛色，懷孕10天左右的小鼠胎兒，眼睛就有色素沉積。或者在出生時，檢查眼瞼色素情況，確定是否是嵌合體。使用同工酶分析首先分析動物特定的同工酶譜系，然后選擇具有不同圖譜的兩種或多種動物作為供體動物提供胚胎。如果獲得的動物是嵌合體，那么同工酶譜中應(yīng)顯現(xiàn)與供體動物相對應(yīng)的特定譜帶，不同品種動物的同工酶均有表現(xiàn)?，F(xiàn)在比較常用的是磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（GPI）分析，其原理是果糖－6－磷酸在GPI作用下，產(chǎn)生葡萄糖－6－磷酸，在6－磷酸葡萄糖脫氫酶和NADP作用下，使G－6－P成為6－磷酸葡萄糖酸鹽，NADP還原為NADPH。經(jīng)GPI染液染色，可顯示出同工酶譜帶。分析時，從嵌合動物中取不同組織器官，勻漿后制成電泳樣本，在醋酸纖維素板上點樣，電泳、染色處理。與標(biāo)準(zhǔn)的同工酶譜對照，鑒定是否是嵌合體。胚胎嵌合的意義胚胎嵌合技術(shù)可以作為研究分析哺乳動物發(fā)生機制的重要手段，例如研究卵裂球分化潛力，研究性分化機制與性比，研究X染色體失活及其作用和研究胚胎細胞基因表達的機制；也可以對生理功能分析的應(yīng)用，例如對免疫功能、遺傳病的研究分析；還可以培育雜種個體，甚至是種間雜種；可以通過制作各種組合的嵌合體，培育新的毛皮動物；利用種間移植，分析胎兒和母體的相互關(guān)系。6.25胚胎保存保存的方法可以分為非冷凍保存和冷凍保存。非冷凍保存是1948年，由M.C.Chang等開創(chuàng)的，他們將兔2細胞胚胎，在同種血清中37℃保存48小時，移植后產(chǎn)仔。非冷凍保存主要有三種方法，即異種動物體內(nèi)保存法、卵和胚胎的37℃保存法和冷藏保存法。1)異種動物體內(nèi)保存法又稱為中間受體培養(yǎng)法，是指把一種動物的胚胎，移入另一種動物的輸卵管或子宮內(nèi)，短期保存后再取出的方法，但并不是所有的動物都能在另一種動物的輸卵管或子宮內(nèi)存活的。瓊脂包埋移植法是指將胚胎移植到1％的瓊脂液中，用口徑適宜的微吸管把胚胎連同少量瓊脂液一起吸入。當(dāng)瓊脂凝結(jié)后再將其壓出，胚胎就被封入圓柱形瓊脂小柱中，每個瓊脂小柱放3－5枚胚胎，再把這個瓊脂小柱封入較大的1.2％瓊脂圓柱內(nèi)。然后，通過胚胎移植技術(shù)，將瓊脂柱移入中間受體輸卵管中。移植前，預(yù)先結(jié)扎輸卵管與子宮的接合部。直接移植法是不經(jīng)瓊脂處理，直接移入預(yù)先結(jié)扎過的受體輸卵管中。經(jīng)過短期培養(yǎng)后，將胚胎從輸卵管內(nèi)沖出，觀察發(fā)育情況。對發(fā)育良好者，移植入同期發(fā)情的同種動物受體內(nèi)，使其產(chǎn)仔。2)冷藏保存法低于室溫，但還達不到冷凍階段的溫度對胚胎進行保存即為冷藏保存法，一般在0－10℃左右保存。由于低溫，可以抑制物質(zhì)代謝的速度和細胞分裂的速度，因之可以延長保存時間。冷凍法冷凍法是指－196℃保存胚胎，在進行超低溫冷凍前，必須進行冷凍保護劑處理。一般說來，在－80℃以上時，細胞則逐漸失去活力，到－130℃以下，細胞內(nèi)的水分呈微細冰晶樣或玻璃樣結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)所有需要能量的反應(yīng)停止，細胞的活動也幾乎停止。最早，小鼠中獲得成功。冷凍過程中細胞受到的損害在冷凍過程中，細胞會受到兩方面的損害。快速冷凍時，細胞內(nèi)形成的冰晶，對細胞膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生機械性損害，這是指冷凍的物理損傷。當(dāng)緩慢降溫時，細胞內(nèi)的水，有足夠的時間完全滲到外面，從冰點緩慢降到細胞完全脫水，往往需要幾個小時或更長時間，細胞一直處于高濃度溶質(zhì)中。如不加抗冷凍劑，細胞也會受到損害，這是冷凍的化學(xué)損傷。防止冷凍損傷在冷凍液中，可以加入冷凍保護劑，如DMSO、丙二醇、乙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。冷凍保護劑的加入，可保護細胞抵抗低溫對細胞產(chǎn)生的損害。在胚胎冷凍過程中，還需要在稍低于溶液冰點時，強行致冷，防止溶液過冷現(xiàn)象的發(fā)生，這種促使溶液結(jié)冰的方法稱為誘發(fā)結(jié)晶或植冰（seeding）。一般，在－3℃――7℃之間誘發(fā)結(jié)晶?，F(xiàn)在，