核糖體和核酶

核糖體和核酶1第1頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月OUTLINERibosomestructureRibosomeFunctionPolyribosomeandProteinsynthesis2第2頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月BackgroundaboutRibosome1953Robinsin,Brown(Plantcell)1955Palade(Animalcell)1958RobertsnameitasRIBOSOMERibosomesexistinalmostallkindsofcells.EukaryoticcellProkaryoticcellMycoplast(支原體）ChloroplastMitochondrionNomembranearoundit3第3頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月Ribosomestructure

◆核糖體(ribosome)是細胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒(ribonucleoproteinpartical),是細胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的細胞器?！艉颂求w的主要成分是核糖體RNA(rRNA),占60%,蛋白質(zhì)(r蛋白質(zhì)),占40%。4第4頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月60S結(jié)構(gòu)大亞基小亞基柄中心突嵴平臺頭部裂溝基部50S30SmRNA40SmRNAtRNA多肽中央管5，3，mRNAA部位

P部位G因子T因子核糖體的四個活性部位5第5頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月Structureofribosome?/v/b/20860082-1402872485.html#208600826第6頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖體的類型細胞有兩種主要類型的核糖體:◆原核細胞的核糖體:

沉降系數(shù)為70S，分子量為2.5x106,由50S和30S兩個亞基組成?！粽婧思毎暮颂求w:

沉降系數(shù)是80S，分子量為2.5x106,由60S和40S兩個亞基組成。7第7頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月Mg2+

濃度對大小亞基的聚合和解離的影響:◆70S核糖體在Mg2+的濃度小于1mmol/L的溶液中易解離;◆當Mg2+

濃度大于10mmol/L,兩個核糖體通常形成100S的二聚體。

8第8頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月鎂離子濃度對核糖體的影響9第9頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月各種來源的核糖體亞基組成

來源完整核糖體核糖體亞基核糖體RNAs

細胞質(zhì)(真核生物)80S60S(大亞基)28S40S(小亞基)18S，5.8S,5S細胞質(zhì)(原核生物)70S50S(大亞基)23S30S(小亞基)16S，5S線粒體(哺乳動物)55-60S45S(大亞基)16S35S(小亞基)12S線粒體(酵母)75S53S(大亞基)21S 35S(小亞基)14S線粒體(高等植物)78S60S(大亞基)26S45S(小亞基)18S，5S葉綠體70S50S(大亞基)23S30S(小亞基)16S，5S 10第10頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖體的化學(xué)組成rRNA蛋白質(zhì)原核細胞核糖體(70S)：1.5:1

真核細胞核糖體(80S):1:1化學(xué)組成70S核糖體50S30S80S核糖體60S40S23SRNA16SRNA5SRNA28SRNA5.8SRNA5SRNA18SRNA~34種蛋白質(zhì)~21種蛋白質(zhì)~45種蛋白質(zhì)~33種蛋白質(zhì)11第11頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月12第12頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖體的裝配原核生物核糖體的裝配◆小亞基的rRNA和蛋白質(zhì)的裝配關(guān)系:

組成核糖體的蛋白質(zhì)和rRNA在大小亞基中均有一定的空間排布。13第13頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月原核生物rRNA前體的加工14第14頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖體結(jié)合蛋白15第15頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖體的合成與裝配16第16頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月17第17頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月RibosomeFunction

核糖體的功能

--蛋白質(zhì)的合成18第18頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月ThreebindingsitefortRNAsAsite:氨酰基-tRNA結(jié)合位點P-site:

肽?；?tRNA結(jié)合位點E-site:

釋放位點/v_show/id_XMTY1ODg5OTY4.html19第19頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月20第20頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月肽鏈合成的起始三元復(fù)合物的生成：起始因子(IF3)30S小亞基+mRNA（起始信號部位）+IF3

—IF3-mRNA-30S三元復(fù)合物30S前起始復(fù)合物的形成：起始因子(IF2)IF3-mRNA-30S三元復(fù)合物+IF2+fMet-tRNAf—IF2-30S-mRNA-fMet-tRNAf70S起始復(fù)合物的形成：GTP——GDP+PiIF2-30S-mRNA-fMet-tRNAf+50S大亞基

—30S-mRNA-50S-fMet-tRNAf+IF221第21頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月IF230S-mRNA-50S-fMet-tRNAf5,3,AUG小亞基肽鏈合成的起始小亞基5,3,AUGIF3IF3IF3-mRNA-30S三元復(fù)合物IF2-30S-mRNA-fMet-tRNAf30S-mRNA-50S-fMet-tRNAfIF2IF3UACfMet大亞基小亞基5,3,AUGUACfMetIF2GTPGDP+PiIF2大亞基小亞基5,3,AUGUACfMetA位IF3-mRNA-30S三元復(fù)合物IF3IF2-30S-mRNA-fMet-tRNAf大亞基IF2GTP小亞基IF3UACfMetIF2IF3小亞基5,3,AUGA位UACfMet大亞基GTPGDP+Pi22第22頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月原核和真核生物蛋白質(zhì)合成起始的區(qū)別內(nèi)容原核生物真核生物完整核糖體70S80S核糖體亞基50S，30S60S，40S起始tRNAfMet-tRNAfMetMet-tRNAiMet起始因子三種至少七種起始復(fù)合物1.30S-mRNA1.40S-Met-tRNAiMet主要順序2.30S-mRNA-fMet-tRNAfMe2.40S-mRNA-Met-tRNAiMet3.70S-mRNA-fMet-tRNAfMe3.80S-mRNA-Met-tRNAiMet23第23頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

肽鏈的延長1.氨酰基-tRNA進入A位肽鏈的延長2.肽鍵的形成3.移位循環(huán)重復(fù)過程參與的因子延長因子（EF)EF-T(EF-1):與氨基酰-tRNA和GTP結(jié)合形成一種復(fù)合物，并將其帶到核糖體上。EF-G(EF-2):幫助肽?；?tRNA由核糖體A位移向P位。GTP:提供能量24第24頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月P位A位P位A位fMetCGG丙

肽鏈的延長UACfMetP位A位3,AUGGCCUCUGGAACG5,CGG丙1.氨酰基-tRNA進入A位2.肽鍵的形成UAC肽基轉(zhuǎn)移酶形成肽鍵P位A位CGG丙3,AUGGCCUCUGGAACG5,UACfMet3.移位(由A位轉(zhuǎn)移至P位）CGG丙fMet3,AUGGCCUCUGGAACG5,EF-G易位酶G因子GTPGDP+PiUACfMetP位A位3,AUGGCCUCUGGAACG5,ACUUAGACUUAGACUUAGACUUAGEF-TGTP密25第25頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月P位A位CGG丙EF-TGTPUACfMetCGG丙fMetUAC肽基轉(zhuǎn)移酶形成肽鍵ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,EF-G易位酶G因子GTPGDP+PiAGA絲CGG

肽鏈合成的終止與釋放P位A位RF釋放因子UGA絲fMet丙甘蘇ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,RFUGA30S50SRF

肽鏈的延長密P位A位CGG丙3,AUGGCCUCUGGAACG5,P位A位fMetCGG丙ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,P位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,P位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,fMet丙AGA絲26第26頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月IF3-mRNA-30S三元復(fù)合物IF3IF2-30S-mRNA-fMet-tRNAfIF230S-mRNA-50S-fMet-tRNAf大亞基IF2GTP小亞基IF3UACfMetIF2IF3小亞基A位UACfMet大亞基GTPGDP+PiACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,P位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,UACfMetCGG丙EF-TGTPCGG丙肽基轉(zhuǎn)移酶形成肽鍵fMetP位A位CGG丙3,AUGGCCUCUGGAACG5,UACEF-G易位酶G因子GTPGDP+PiP位A位fMetCGG丙ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,AGA絲P位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,CGGP位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,AGA絲fMet丙P位A位UGARF釋放因子UGA30S50SRFRF絲fMet丙甘蘇ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,肽鏈合成的起始肽鏈的延長肽鏈合成的終止與釋放多肽鏈的合成27第27頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖體合成的蛋白質(zhì)

外輸?shù)鞍祝ǚ置诘鞍祝河筛街颂求w合成，大多從細胞分泌出去。

結(jié)構(gòu)蛋白：由游離核糖體合成，多分布細胞基質(zhì)中。某些結(jié)構(gòu)蛋白（膜鑲嵌蛋白、溶酶體酶蛋白、等）是由附著核糖體合成的。完28第28頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖體蛋白與rRNA的功能

核糖體上具有一系列與蛋白質(zhì)

合成有關(guān)的結(jié)合位點與催化位點29第29頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月與mRNA的結(jié)合位點與新?lián)饺氲陌滨?tRNA的結(jié)合位點——氨酰基位點，又稱A位點與延伸中的肽酰-tRNA的結(jié)合位點——肽酰基位點，又稱P位點肽酰轉(zhuǎn)移后與即將釋放的tRNA的結(jié)合位點——E位點(exitsite)與肽酰tRNA從A位點轉(zhuǎn)移到P位點有關(guān)的轉(zhuǎn)移酶

(即延伸因子EF-G)的結(jié)合位點肽酰轉(zhuǎn)移酶的催化位點與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的其它起始因子、延伸因子和終止因子的結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點30第30頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月在核糖體中rRNA是起主要作用的結(jié)構(gòu)成分具有肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性；為tRNA提供結(jié)合位點(A位點、P位點和E位點)；為多種蛋白質(zhì)合成因子提供結(jié)合位點；在蛋白質(zhì)合成起始時參與同mRNA選擇性地結(jié)合以及在肽鏈的延伸中與mRNA結(jié)合；核糖體大小亞單位的結(jié)合、校正閱讀(proofreading)、無意義鏈或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等都與rRNA有關(guān)。31第31頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月r蛋白質(zhì)的主要功能對rRNA折疊成有功能的三維結(jié)構(gòu)是十分重要的；在蛋白質(zhì)合成中,某些r蛋白可能對核糖體的構(gòu)象起“微調(diào)”作用；在核糖體的結(jié)合位點上甚至可能在催化作用中,核糖體蛋白與rRNA共同行使功能。

32第32頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月問題如何證明在核糖體合成蛋白質(zhì)過程中起主要功能作用的是RNA，而不是蛋白質(zhì)？？33第33頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

蛋白質(zhì)合成抑制劑（抑制核糖體與tRNA結(jié)合）☆抗生素☆嘌呤霉素34第34頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月多聚核糖體(polyribosome或polysome)蛋白質(zhì)正在合成時的一種狀態(tài)。35第35頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月多聚核糖體36第36頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月多聚核糖體(polyribosome或polysome)概念核糖體在細胞內(nèi)并不是單個獨立地執(zhí)行功能，而是由多個甚至幾十個核糖體串連在一條mRNA分子上高效地進行肽鏈的合成，這種具有特殊功能與形態(tài)結(jié)構(gòu)的核糖體與

mRNA的聚合體稱為多聚核糖體。

多聚核糖體的生物學(xué)意義 細胞內(nèi)各種多肽的合成，不論其分子量的大小或是mRNA的長短如何，單位時間內(nèi)所合成的多肽分子數(shù)目都大體相等。 以多聚核糖體的形式進行多肽合成，對mRNA

的利用及對其濃度的調(diào)控更為經(jīng)濟和有效。37第37頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA在生命起源中的地位及其演化過程38第38頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月生命是自我復(fù)制的體系三種生物大分子，只有RNA既具有信息載體功能又具有酶的催化功能。因此，推測RNA

可能是生命起源中最早的生物大分子。核酶(ribozyme)：具有催化作用的RNA。由RNA催化產(chǎn)生了蛋白質(zhì)39第39頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA代替了RNA的遺傳信息功能

DNA雙鏈比RNA單鏈穩(wěn)定；

DNA鏈中胸腺嘧啶代替了RNA鏈中的尿嘧啶，使之易于修復(fù)。40第40頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)取代了絕大部分RNA酶的功能蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性與構(gòu)象的多變性；與RNA相比，蛋白質(zhì)能更為有效地催化多種生化反應(yīng)，并提供更為復(fù)雜的細胞結(jié)構(gòu)成分，逐漸演化成今天的細胞。

41第41頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖體與癌癥蛋白質(zhì)是生命活動的最終執(zhí)行者，核糖體擔負著細胞中蛋白質(zhì)的合成，因此核糖體在整個生命過程中發(fā)揮重要功能。核糖體的生物合成和轉(zhuǎn)錄控制在細胞處理過程中多個水平進行。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些腫瘤抑制子和前癌基因可以影響核糖體成熟，通過改變蛋白質(zhì)合成機器中的某些組分而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。42第42頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月單一蛋白質(zhì)突變控制核糖體生物合成

低等生物L(fēng)16：在酵母菌中進行的基因靶向試驗表明單一一種蛋白質(zhì)的去除如L16，導(dǎo)致60s核糖體大單位減少，這直接與多核糖體減少和細胞增殖缺陷相關(guān)。因此僅一種核糖體蛋白質(zhì)的表達被破壞就能夠引起核糖體產(chǎn)生的減少。其它的蛋白質(zhì)：在果蠅中，單一的核糖體蛋白質(zhì)突變就可以導(dǎo)致一組綜合性突變，被稱為minute。Mintue

蒼蠅是以體積減少為特征，失去生育能力和隱性的致死性。許多直接和間接的證據(jù)已經(jīng)證實minute細胞核糖體含量降低，因此蛋白質(zhì)合成能力降低。蛋白質(zhì)合成的減少導(dǎo)致了細胞生長和增殖的降低。43第43頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月高等生物：S6：小鼠中去除40s核糖體蛋白質(zhì)S6，直接導(dǎo)致了核糖體生物合成的缺陷和細胞增殖的降低。而S6磷酸化可以被癌細胞中失調(diào)的細胞外信號進行調(diào)節(jié)。S6磷酸化與特異的一組被稱為TOP的mRNA翻譯相關(guān)（TOP:aterminaloligopyrimidinebractinthe5’untranslatedregion(UTR)）。由TOP基因編碼的蛋白質(zhì)本身即為一種原癌基因，因此，TOP基因的表達失調(diào)也許啟動了腫瘤的發(fā)生。哺乳動物中，S6磷酸化的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的。這種復(fù)雜性提高歸因于另一種激酶S6K2的存在。44第44頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月S3a：在腫瘤細胞中過量表達。顯然單個核糖體蛋白質(zhì)刪除在許多模型組織中可以直接影響細胞的生長，但是對核糖體蛋白質(zhì)的過量表達還沒有清晰明朗的認識。核糖體蛋白質(zhì)S3a過量表達可以誘導(dǎo)NIH3T3細胞轉(zhuǎn)型突變，并在裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生。S3a誘導(dǎo)轉(zhuǎn)型突變的能力依賴于其抑制程序性死亡的作用，因此S3a也許引起了抗凋亡蛋白的上調(diào)。45第45頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月癌癥和核糖體的生物合成先天性角化不良癥

DKC1編碼假尿嘧啶合成酶，通過在特異位點將尿嘧啶轉(zhuǎn)變成假尿嘧啶而介導(dǎo)了rRNA轉(zhuǎn)錄前的調(diào)節(jié)。DKC1基因的突變與DC相關(guān)。在酵母和蒼蠅中，DKC1的缺陷導(dǎo)致了rRNA修飾的損傷與核糖體生物合成過渡有關(guān)

DKC1也與端粒酶中的RNA合成相關(guān)，是否核糖體功能障礙引起了DC的病理過程仍需在動物模型中進一步驗證。46第46頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月先天性障礙性貧血：這種疾病已經(jīng)被確定與核糖體蛋白質(zhì)S19突變相關(guān)，一種由于核糖體合成缺陷而使機體具有癌癥易感性的疾病。在Drosophila中，僅一個核糖體蛋白質(zhì)的突變既可以造成minutue表型。先天性障礙性貧血病人，在出生時有一個生長不足，表現(xiàn)為嚴重的生長遲緩現(xiàn)象。兩這是否具有相同的發(fā)生機制還需要進一步闡明。47第47頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月AproteinboundtoaspecificDNAsequencewillinterferewiththedigestionofthatregionbyDNaseI.Anend-labelledDNAprobeisincubatedwithaproteinextractorapurifiedDNA-bindingfactor.TheunprotectedDNAisthenpartiallydigestedwithDNaseIsuchthatonaverageeveryDNAmoleculeiscutonce.Digestionproductsarethenresolvedbyelectrophoresis.ComparisonoftheDNaseIdigestionpatterninthepresenceandabsenceofproteinwillallowtheidentificationofafootprint(protectedregion)****DenaturingPAGEFootprintExp.IdentificationofTFbindingsite:DNase1Footprinting48第48頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

RNApol在DNA上結(jié)合位點的鑒定足跡法原理：

?限制酶切割結(jié)合有RNApol的DNA→大分子DNA?末端標記該DNA（Klenow片段標記3’,堿性磷酸酯酶標記5’）

?用內(nèi)切酶降解DNA（控制反應(yīng)條件）

?凝膠電泳分離，放射自顯影觀察49第49頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月限制酶切分離大片段DNA50第50頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月末端標記大分子DNA重新結(jié)合RNApol

作對照直接用DNase進行降解電泳用微量DNase降解電泳51第51頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月52第52頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

?用足跡法鑒定出來的RNApol與DNA的結(jié)合區(qū)域為

+20~－50（－40），大約60~70bp

53第53頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶(ribozyme)：有催化活性的RNA1982年，美國ThomasCech在研究四膜蟲rRNA自我剪接時發(fā)現(xiàn)，在沒有任何蛋白酶參與下，含有413bp干擾序列（IVS）的前體rRNA發(fā)生了自切割.

同時加拿大的SidneyAltman發(fā)現(xiàn)RNaseP分子中的RNA組分有催化活性；1989年分享了Noble化學(xué)獎。不僅拓寬了生物催化劑的領(lǐng)域，而且對RNA的生物學(xué)功能開創(chuàng)了一種歷史性的新認識：RNA不僅具有儲存和傳遞遺傳信息的功能，而且還具有生物催化劑的功能，在一定程度上可以說，RNA一身兼有DNA和蛋白質(zhì)兩大類生物大分子的功能。54第54頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月●核酶真核生物rRNA的自身剪切

四膜蟲

26SrRNA核酶（ribozyme）應(yīng)用

前體6.4kb414bp內(nèi)含子

5.986kb

無酶催化，自身剪接具有催化功能的RNA

切割特異性RNA序列具特定的二級結(jié)構(gòu)槌頭結(jié)構(gòu)人工合成核酶的槌頭結(jié)構(gòu)破壞HIV病毒

55第55頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月底物催化部分圖13-1156第56頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月酶底物圖13-1257第57頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月Matchthefollowingwiththeirroleintranslation._____AseriesofthreetRNAbasescomplementarytoamRNAcodon.(ans)

_____Theribozymethatformspeptidebondsbetweenaminoacidsduringtranslation.(ans)

_____TheribosomalsubunitthatbindstomRNAtoformtheinitiationcomplex.(ans)

_____Theribosomalsitewhereanaminoacyl-tRNAfirstattachesduringtranslation.(ans)

_____TheribosomalsitewherethegrowingaminoacidchainistemporarilybeingheldbyatRNAasthenextcodoninthemRNAisbeingread.(ans)

_____AcomplexofanaminoacidandatRNAmolecule.(ans)

_____ThesequenceofbasesonmRNAtowhicha30Sor40Sribosomalsubunit