臨床基因診斷學(xué)質(zhì)控方案

臨床基因診斷學(xué)質(zhì)控方案人員培訓(xùn)一、人員資質(zhì)每個從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的工作人員都必須經(jīng)過衛(wèi)生行政部門指定的專門培訓(xùn)，經(jīng)理論考試和實(shí)驗(yàn)考核合格取得上崗證后方可上崗；上崗證有效期為5年。1.實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置和工作流程。2.基因診斷學(xué)的基本理論和技術(shù)。3.質(zhì)量體系文件的建立及規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)操作。4.防污染和生物安全的基本要點(diǎn)。5.分子診斷試劑的質(zhì)檢，如核酸提取效率和基因擴(kuò)增效率的6.各類儀器如擴(kuò)增儀、移液器和測序儀等的使用、維護(hù)和7.標(biāo)本的正確采集、運(yùn)送和保存及其檢測的有效性評價。準(zhǔn)曲線參數(shù)的分析等。9.檢驗(yàn)結(jié)果的分析、判斷及向臨床的合理解釋或建議。實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置和環(huán)境為防止污染，必須對臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)設(shè)置。原則上按其功能應(yīng)分為四個在空間上完全獨(dú)立的區(qū)域根據(jù)自身情況進(jìn)行適當(dāng)合并或增加，如使用實(shí)時定量擴(kuò)增儀(擴(kuò)增產(chǎn)物閉管檢測),后2個區(qū)域可合并；如標(biāo)本量大或者檢測項目多，可適當(dāng)增加一些區(qū)域(如標(biāo)本制備區(qū)可分隔為標(biāo)本提取區(qū)和模板加入?yún)^(qū)；產(chǎn)物分析區(qū)可分為產(chǎn)物分析I區(qū)、Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)等，分別用于電泳、雜交和測序等，以避免交叉污染)。各區(qū)無論是在靜止還是使用狀態(tài)，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接各區(qū)在功能上也需保持獨(dú)立：(1)試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)：用于儲存試劑的制備、分裝和存放，擴(kuò)增反應(yīng)混合液的配制和分裝，以及離心管和吸頭等消耗品的儲質(zhì)量分析、儲存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管，以及二步法RT-PCR時單鏈互補(bǔ)DNA(cDNA)的合成。(3)擴(kuò)增區(qū)：用于基因擴(kuò)增包括巢式擴(kuò)增。(4)產(chǎn)物分析區(qū)：用于基因擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析，如電泳、雜交和測序分析等。人員、物品以及實(shí)驗(yàn)室的清潔都必須嚴(yán)格遵循單一方向的順實(shí)驗(yàn)室各區(qū)應(yīng)有獨(dú)立的新風(fēng)系統(tǒng)，與其他區(qū)域或?qū)嶒?yàn)室不得混用。各區(qū)應(yīng)配置固定和移動紫外線燈，傳遞窗內(nèi)也應(yīng)配置紫外線燈；波長254nm,照射時離實(shí)驗(yàn)區(qū)的高度為60～90cm,時間至少1個小時，并定期監(jiān)測其有效性。實(shí)驗(yàn)室入口處必須有明示生物危險的標(biāo)志以及禁止無關(guān)人員進(jìn)入的標(biāo)志和措施。如果各區(qū)的環(huán)境溫/濕度會對儀器運(yùn)行或檢測分析造成影響，應(yīng)對環(huán)境溫/濕度進(jìn)行監(jiān)控，制定溫濕度控制的有效范圍并提供監(jiān)控記錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)用途，制定適宜的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，如DNA檢測用水應(yīng)為高壓的去離子雙蒸水、RNA檢測用水則還應(yīng)進(jìn)一步處理以除去核糖核酸酶(RNase),并定期檢測。儀器設(shè)備及其校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室各區(qū)應(yīng)有各自專用的儀器設(shè)備，包括工作服、工作鞋、一次性消耗品、辦公及清潔用具等，有明顯的標(biāo)識或顏色標(biāo)識，便儀器應(yīng)有運(yùn)行狀態(tài)標(biāo)識，需校準(zhǔn)的儀器還應(yīng)有校準(zhǔn)狀態(tài)的標(biāo)識。各區(qū)基本配備還需包括：列移液器及配套的吸頭、醫(yī)用冰箱等。(2)標(biāo)本制備區(qū)：生物安全柜、臺式高速離心機(jī)和(或)高速冷凍離心機(jī)(RNA檢測必備)、振蕩器、恒溫金屬浴、系列移液器及配套的帶濾芯吸頭，醫(yī)用冰箱等。(3)擴(kuò)增區(qū)：PCR擴(kuò)增儀，系列移液器及配套的帶濾芯吸頭(巢式擴(kuò)增需備)。(4)產(chǎn)物分析區(qū)：系列移液器及配套的帶濾芯吸頭、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、芯片檢測儀或測序儀等(需根據(jù)所用檢測方法而定)。二、儀器的校準(zhǔn)臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室需要定期校準(zhǔn)的儀器主要有：PCP擴(kuò)增參數(shù)均符合儀器制造商說明書中規(guī)定的技術(shù)指標(biāo)。舉例如下：1.PCP擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀應(yīng)定期校準(zhǔn)，至少每年1次；儀器在安裝使用前、維修后可能對結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響時，室內(nèi)質(zhì)控出現(xiàn)失控或者出現(xiàn)異常趨勢采取一般措施不能糾正時，都應(yīng)對其進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增儀(或稱定性擴(kuò)增儀)的性能參數(shù)主要為溫控系統(tǒng)，包括溫度的準(zhǔn)確性、均一性和升降溫速度。實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增儀的性能參數(shù)包括溫控系統(tǒng)(溫度的準(zhǔn)確性、均一性和升降溫速度)和光路系統(tǒng)(背景校正、目標(biāo)區(qū)校正以及熒光波長的準(zhǔn)確度和重復(fù)性)。擴(kuò)增儀的校準(zhǔn)通常應(yīng)由廠方專業(yè)工程師來完和光路系統(tǒng)的各性能參數(shù)均符合儀器制造商說明書中規(guī)定的技術(shù)擴(kuò)增儀故障修復(fù)后，應(yīng)對其性能進(jìn)行驗(yàn)證，必要時進(jìn)行校準(zhǔn)。下合適的方式進(jìn)行相關(guān)的檢測、驗(yàn)證(適合定量項目):(1)可校準(zhǔn)的項目結(jié)果超出允許范圍時，實(shí)施校準(zhǔn)。(2)質(zhì)控品檢測結(jié)果應(yīng)在質(zhì)控范圍內(nèi)。(3)與其他儀器的檢測結(jié)果比較，或者使用留樣再次檢測后決定水平，至少4份標(biāo)本測量結(jié)果偏倚不超過1/2TEa(總的允許2.移液器由于微量取樣，移液器的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，應(yīng)當(dāng)定期校準(zhǔn)。校準(zhǔn)周期應(yīng)根據(jù)使用頻率來確定，至少1次/年；性能參數(shù)為容量?？勺孕羞M(jìn)行或送計量部門檢定，但建議送生產(chǎn)廠商校準(zhǔn)；檢定或校準(zhǔn)應(yīng)根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)文件ISO/ DIS8655、國家技術(shù)監(jiān)督局頒發(fā)的有關(guān)移液器的中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程JJG646-2006《移液器檢定規(guī)程》或JJG646-90附有相關(guān)數(shù)據(jù)的結(jié)果報告或檢定/校準(zhǔn)證書。校準(zhǔn)時應(yīng)盡量選擇常用的取樣容量，可調(diào)式移液器應(yīng)選2～3個容量點(diǎn)進(jìn)行校準(zhǔn)，以覆蓋常用的或標(biāo)定的容量范圍。合格標(biāo)準(zhǔn)：準(zhǔn)確度(標(biāo)準(zhǔn)誤差)和精確度(重現(xiàn)性)應(yīng)符合相應(yīng)規(guī)格移液器使用說明書中規(guī)定的技術(shù)性能指標(biāo)。對具有兩臺或兩臺以上同類儀器，并開展相同檢測項目的實(shí)評價不少于2次或有以下情況應(yīng)進(jìn)行一次比對：質(zhì)控結(jié)果不一致，定量項目的比對方案需參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T407-2012《醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)定量檢驗(yàn)結(jié)果的可比性驗(yàn)證指南》設(shè)歸方程，計算在醫(yī)學(xué)決定水平下的系統(tǒng)誤差(偏倚%),應(yīng)小于1/2TEa(總的允許誤差)。定性項目為選擇2份陰性和3份陽性患者結(jié)果須符合預(yù)期結(jié)果。每次比對的結(jié)果應(yīng)有記錄和糾正措施。檢驗(yàn)項目的方法學(xué)性能評價檢驗(yàn)項目在引入常規(guī)臨床實(shí)踐前應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)性能評價或驗(yàn)和可報告結(jié)果(定性試驗(yàn)),或者方法線性以及參考區(qū)間(定量試驗(yàn)),和(或)臨床有效性或適用性等性能指標(biāo)。不同檢測項目其分析性能評價的側(cè)重點(diǎn)可能會有所不同，重要的是要用數(shù)據(jù)證明其分析性能可達(dá)到預(yù)期的質(zhì)量要求。項目名稱推薦RCV(%)項目名稱推薦RCV(%)乙型肝炎核酸檢測丙型肝炎核酸檢測試劑和消耗品的質(zhì)量管理1.臨床收費(fèi)檢測項目應(yīng)使用經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)合格的臨床檢測試劑。至于選擇哪家試劑，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的技并建立相應(yīng)的試劑質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)操作程序；內(nèi)容至少應(yīng)包括：①外觀提取效率和核酸擴(kuò)增效率的評估。2.試劑應(yīng)嚴(yán)格按照生產(chǎn)商說明書的要求進(jìn)行儲存。商品化3.試劑的比對，包括更換試劑的生產(chǎn)商或更換試劑的批號時(1)標(biāo)本：選取已用老試劑檢測過的患者標(biāo)本5份，其中1份(2)檢測：用新試劑重復(fù)測定上述5份標(biāo)本，計算偏倚(%)。(3)判斷標(biāo)準(zhǔn)：小于實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控RCV,或者1/2允許總誤差(TEa)。主要包括濾芯的屏蔽功能、管壁是否含有擴(kuò)增抑制物以及離心管的密封性能等。沒有“無DNase和RNase”標(biāo)識的消耗品需要進(jìn)標(biāo)本的質(zhì)量管理應(yīng)根據(jù)檢測項目及其試劑說明書的要求建立相應(yīng)的標(biāo)本采集標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP),并對臨床標(biāo)本采集人員進(jìn)行培訓(xùn)。采集標(biāo)本時標(biāo)本采集部位必須進(jìn)行清潔消毒處理，以去掉污染的微生物破壞靶微生物。例如：采集女性宮頸口或男性尿道口分泌物檢測人乳頭瘤病毒DNA,首先是用棉拭子將宮頸口或尿道口過多的分行取樣。三、標(biāo)本采集中的防污染須高壓滅菌，而對于RNA檢測標(biāo)本，必須采用能完全滅活核酸核糖酶(RNase)的方式進(jìn)行消毒處理。采集中要特別注意防污染，四、標(biāo)本的采集和保存1.全血、骨髓和血清(漿)標(biāo)本對于DNA檢測，血清標(biāo)本的采集和保存可按照一般的血清標(biāo)本處理程序；血漿標(biāo)本則要求EDTA鉀或鈉鹽，或者枸櫞酸鈉抗凝(不使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，且在核酸提取過程中難以將其去除)。對于RNA檢測，標(biāo)本的處理和保存方式對測定結(jié)果可能有決定性影響：用于RNA測定最好是使用EDTA或枸櫞酸鈉抗凝血漿標(biāo)本，抗凝后3小時內(nèi)分離血漿；如使用血清標(biāo)本，則需盡快(1小時內(nèi))分離血清。全血和骨髓標(biāo)本也需使用EDTA或枸櫞酸鈉抗凝。外周血單核細(xì)胞可從抗凝血制備，主要有兩條途徑：①使用淋巴細(xì)胞分離液分離制備；②使用紅細(xì)胞裂解液，裂解全血中的紅細(xì)胞，經(jīng)生理鹽水反復(fù)洗滌后獲得。標(biāo)本的長期保存應(yīng)在-70℃下，并避免反復(fù)凍融和污染。如用于DNA檢測，可于4℃下短期保存；如用于RNA檢測，則應(yīng)在采血后，盡快提取RNA。2.痰液標(biāo)本最好是晨起用生理鹽水反復(fù)漱口后用力咳出桿菌DNA測定標(biāo)本。由于痰標(biāo)本中含有大量黏蛋白和雜質(zhì)，故為選擇適當(dāng)液化劑在規(guī)定的時間及溫度下進(jìn)行液化處理；如果痰中帶血，由于血紅蛋白是Taq酶抑制物，必須選用適當(dāng)紅細(xì)胞裂解液處理后再液化。液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取，可保存于-70℃下。此外，對用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測，3.棉拭子標(biāo)本在使用PCR方法檢測性病病原體(如沙眼衣原體)時，臨床標(biāo)本一般為棉拭子。標(biāo)本取材是關(guān)鍵，衣原體感染上皮細(xì)胞，因此取材時一定要取到細(xì)胞(注意：分泌物或尿沉渣中檢出的陽性率均較低)。無論男、女取材均需使用特制的拭子，男性應(yīng)進(jìn)入尿道2～3cm,女性應(yīng)進(jìn)入宮頸口2cm,并停留、稍做轉(zhuǎn)動后取出。將已采樣的棉拭子置于適量生理鹽水中，充分振蕩洗滌后，室溫靜置5～10分鐘，待大塊狀物下沉后，取上清立即離心，其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取，則需保存于-70℃以下。4.膿液標(biāo)本膿液的處理依情況而定，如用于分枝桿菌(如結(jié)核桿菌)核酸測定的標(biāo)本，黏稠膿液的處理同痰標(biāo)本的處理模式，先進(jìn)行液化，再離心取沉淀物提取DNA;水樣的膿液則直接離心，沉淀物用生理鹽水洗2～3次后，即可用于DNA提取。對于水，充分振蕩后，靜置，取上清立即離心，沉淀物用于DNA提取；如為水樣，則按上述直接離心取沉淀物即可。沉淀物標(biāo)本的保存條件為-70℃以下。5.各種體液標(biāo)本臨床體液標(biāo)本包括胸水、腹水、腦脊液和尿液等，胸腹水和腦脊液需在無菌條件下抽取并置于含有適量抗凝劑的無菌瓶中送檢；尿液標(biāo)本的采集是在尿道口消毒后取中段尿。這類標(biāo)本可按水樣標(biāo)本的方式離心取沉淀物后提取核酸；但對于血性體液應(yīng)先選用紅細(xì)胞裂解液處理后再使用。沉淀物標(biāo)本6.組織標(biāo)本臨床組織標(biāo)本包括新鮮組織和固定組織，取樣時必須進(jìn)行病理學(xué)評估以確定含有病變組織并盡量保證靶細(xì)胞或癌細(xì)胞數(shù)量足夠。新鮮組織的一般處理步驟：①如為組織塊，首先用生理鹽水洗2～3次，然后將其搗碎或切碎進(jìn)行組織勻漿。②如為細(xì)針穿刺或鏡下活檢標(biāo)本，則直接進(jìn)行組織勻漿，加入Trizol或其他類即置入液氮中保存或液氮速凍后轉(zhuǎn)入—80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?；或者?5分鐘內(nèi)固定，采用10%中性緩沖甲醛固定液，體積必須為病變組織體積的10倍以上。小的活檢組織標(biāo)本的固定時間一般為6～12小時，大一些的手術(shù)標(biāo)本固定時間為12～48小時，然后進(jìn)行石蠟包埋和切片(厚度為5～10μm)。石蠟切片：經(jīng)影響。注意，切片或刮片時必須有措施避免不同病例組織間的交實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床標(biāo)本的運(yùn)送條件做出相應(yīng)的規(guī)定，同時還需符合生物安全的要求。原則上：2.如標(biāo)本不能在規(guī)定時間送檢，需作穩(wěn)定化處理：RNA測定的血液或體液標(biāo)本加入異硫氰酸胍(GITC,終濃度≥4mmol/L);DNA測定標(biāo)本用EDTA抗凝血。經(jīng)穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需冷藏即可運(yùn)送(室溫7日以內(nèi))。新鮮組織標(biāo)本，置于液氮中送檢，或固定后24小時內(nèi)送檢，標(biāo)準(zhǔn)化固定劑為10%中性緩沖甲醛溶液(pH7.2～7.4),乙醇、丙酮也可用于組織標(biāo)本的固定。六、標(biāo)本的接收和質(zhì)量評價1.接受的標(biāo)本應(yīng)收集在原始容器中，不能接受從其他檢測如2.標(biāo)本接收時，需對其采集質(zhì)量進(jìn)行初步評價，并記錄其性狀；評價方法包括肉眼觀察(是否溶血或脂血等，并明確其是否會對相應(yīng)的檢測有影響)、顯微鏡下觀察(有無細(xì)胞、細(xì)胞的組成或比例，如痰標(biāo)本如果白細(xì)胞數(shù)極少，則可能沒有采集到真正的痰)等。組織標(biāo)本必須包括檢測的有效性驗(yàn)證，由具有病理診斷資質(zhì)的醫(yī)師對每例標(biāo)本的病變或腫瘤細(xì)胞含量進(jìn)行評估，并標(biāo)出病變3.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立嚴(yán)格的不合格標(biāo)本拒收制度及標(biāo)準(zhǔn)，凡不符合標(biāo)準(zhǔn)要求(如無簽、遲送的標(biāo)本，標(biāo)本量不足、嚴(yán)重溶血或脂血的標(biāo)本，肝素抗凝或其他未按規(guī)定采集的標(biāo)本，未取到病變組織或細(xì)胞的標(biāo)本，有自溶、退變或組織結(jié)構(gòu)不清、大片出血等改變的蠟塊組織標(biāo)本)應(yīng)拒絕接受，并盡快與有關(guān)方面聯(lián)系，說明拒收原因，并明確標(biāo)本的接收條件。對于不合格而必須進(jìn)行檢測的標(biāo)本(如某些特殊原因),簽收人員應(yīng)記錄標(biāo)本的缺陷并在報告中注明。4.標(biāo)本一旦接受，立即貼上相應(yīng)的唯一性標(biāo)識，并做好登記。質(zhì)量控制臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制的核心問題就是要避免假陽性和假陰性，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)室制定的室內(nèi)質(zhì)量控制程序(SOP)應(yīng)有針對這些問題的具體措施。(一)核酸提取的質(zhì)量控制待測標(biāo)本中核酸的提取是決定擴(kuò)增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟。干擾物；使待擴(kuò)增的靶序列暴露及核酸模板得到濃縮。新的試劑或提取方法引入臨床實(shí)踐前，或使用要求高質(zhì)量核酸的檢測方法時，應(yīng)評價核酸的提取效率。評價內(nèi)容包括核酸的濃度、純度和完整性。紫外分光光度法A2s讀數(shù)測定常用來計算核酸濃度；A260/A28和A260/A23比值常用來分析核酸純度；凝膠電泳法常用來判斷核酸的完整性；通過內(nèi)參基因或者在標(biāo)本制備前加入內(nèi)標(biāo)的方法，主要用來觀察提取的核酸標(biāo)本中是否存在擴(kuò)增的抑制物或干擾物。(二)檢測過程的質(zhì)量控制1.陰性質(zhì)控物的選擇及其對污染的質(zhì)控陰性質(zhì)控的設(shè)置在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制中有著特殊的作用：監(jiān)測污染的發(fā)生。其類型包括：(1)陰性質(zhì)控品：與臨床標(biāo)本盡可能同基質(zhì)的外部質(zhì)控品，非試劑盒自帶的陰性對照。與臨床標(biāo)本同步提取和擴(kuò)增檢測，如檢污染(試劑或?qū)嶒?yàn)室被污染還是標(biāo)本間的交叉污染)。(2)僅含有擴(kuò)增反應(yīng)液的試劑空白管：用以排查試劑是否被(3)開蓋空管：將1個或數(shù)個空管開蓋后靜置于標(biāo)本制備區(qū)或擴(kuò)增區(qū)30～60分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液，同時以水代替模板進(jìn)行擴(kuò)增，用以排查實(shí)驗(yàn)室是否存在以前擴(kuò)增產(chǎn)物的遺留(4)二步法RT-PCR基因表達(dá)檢測時還需設(shè)置以未逆轉(zhuǎn)RNA為模板的陰性質(zhì)控，以排除基因組的潛在污染。2.陽性質(zhì)控品的選擇及其對擴(kuò)增檢測的質(zhì)控(1)陽性質(zhì)控品的選擇：陽性質(zhì)控的設(shè)置在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中①內(nèi)反應(yīng)陽性質(zhì)控品(也稱內(nèi)標(biāo)):用來監(jiān)控可能存在的抑制物或干擾物的出現(xiàn)，避免檢驗(yàn)結(jié)果假陰性。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無與基因的缺失或Y染色體序列有關(guān)時，內(nèi)反應(yīng)質(zhì)控至關(guān)重要。內(nèi)標(biāo)提取核酸中所含有的相對恒定表達(dá)的看家基因。它與靶基因同步擴(kuò)增或者在同一反應(yīng)管中進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。另一類為競爭性擴(kuò)增產(chǎn)物相對逐漸減少，但兩種擴(kuò)增產(chǎn)物的比值和兩種初始狀態(tài)時模板分子數(shù)的比值是一致的，因此，它的加入也是目前PCR定量方法中最準(zhǔn)確的方法，可以消除PCR擴(kuò)增過程中反應(yīng)管之間以及標(biāo)本之間存在的差異。②外部陽性質(zhì)控品：與臨床標(biāo)本盡可能同基質(zhì)的陽性質(zhì)控a.定性實(shí)驗(yàn)：對于病原體核酸是否存在或靶基因是否表達(dá)的檢測，應(yīng)至少帶有1個臨界陽性質(zhì)控品，防止弱陽性漏檢。對于基因突變或分型檢測，應(yīng)有針對每一突變位點(diǎn)或基因型別的陽性質(zhì)b.定量實(shí)驗(yàn)：原則上陽性質(zhì)控品應(yīng)有2～3個濃度水平，能夠覆蓋方法學(xué)所涉及的測量范圍?？蛇x用在線性范圍或報告范圍的上下限值濃度處的質(zhì)控品，且最好能在接近醫(yī)學(xué)決定水平處選一個質(zhì)控品，因?yàn)榕R床最關(guān)心的是在醫(yī)學(xué)決定水平濃度處檢驗(yàn)結(jié)果(2)質(zhì)控頻次、放置位置和分析批①頻次：原則上應(yīng)每隔十幾份臨床標(biāo)本即插入1份質(zhì)控品，以最大可能地檢出試驗(yàn)的隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差。但考慮到成本和標(biāo)本量的問題，至少每個分析批應(yīng)設(shè)置一組陰陽性質(zhì)控品以評價中的位置也不要永久性固定在某一個孔，建議在每次擴(kuò)增檢測時擴(kuò)增有效性。③分析批：指的是在相同條件下的一組測定，預(yù)期在此條件下檢測系統(tǒng)的正確度和精密度是穩(wěn)定的。(3)質(zhì)控方法的選擇和應(yīng)用可判斷為該批次檢測有效。②定量試驗(yàn)：外部陽性質(zhì)控需要采用統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控方法來分析，以保證檢測結(jié)果的精密度和穩(wěn)定性。通常采用的方法為：a.首先采用“即刻法”質(zhì)控方法。質(zhì)控品與臨床標(biāo)本平行測定3個批次后即可開始質(zhì)控分析，利用SI值表判定是否有異常值存在。b.當(dāng)這組數(shù)據(jù)擴(kuò)大到20個批次的有效值時，啟用Levey-Jennings質(zhì)控圖方法。首先對這20批次數(shù)據(jù)進(jìn)行離群值檢驗(yàn)，剔除超過X±3S外的數(shù)據(jù)后計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，建立暫定中心線(均值)和控制限，繪制質(zhì)控圖?？v坐標(biāo)(y軸)可直接使用質(zhì)控品擴(kuò)增后的拷貝數(shù)/ml(或IU/ml),或者將其轉(zhuǎn)換為對數(shù)值來進(jìn)行統(tǒng)計計算(由于基因擴(kuò)增結(jié)果的原始數(shù)據(jù)通常很大，建議使用后者更為方便)。橫坐標(biāo)(x軸)為分析批，如當(dāng)日檢測有多個批次時都應(yīng)標(biāo)出。c.隨著質(zhì)控數(shù)據(jù)的不斷累積，將在控質(zhì)控數(shù)據(jù)與前20限進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。d.當(dāng)同時測定一個以上的質(zhì)控品濃度時，可采用Z-分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖法將其繪制在同一張圖上，方便記錄和分析。e.Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法，具有具有更強(qiáng)的辨別能力，有助于采取相應(yīng)的措施進(jìn)行改正。(4)失控原因分析及處理：失控信號的出現(xiàn)受多種因素的影有具體的措施或SOP文件用于失控的原因查找和分析糾正：①填寫失控報告，報告專業(yè)主管。②回顧整個試驗(yàn)過程、觀察所有標(biāo)本的檢測結(jié)果情況，分析查找最有可能導(dǎo)致誤差的因素。偶準(zhǔn)、環(huán)境因素。系統(tǒng)誤差造成的失控，首先考慮質(zhì)控物或試劑原因，再查找儀器等問題。③如未發(fā)現(xiàn)明顯差錯，可按下列步驟去控品失效或保存不當(dāng)；進(jìn)行儀器維護(hù)/校準(zhǔn)或更換試劑，以查明是系。④根據(jù)分析所得的失控原因，判斷結(jié)果是真失控還是假失控，結(jié)合一定的補(bǔ)救措施，做出是否發(fā)出當(dāng)批患者報告的決定。⑤做好記錄，防止同類問題再次出現(xiàn)。3.定量試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量控制每批次檢測中標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)不少于4個濃度水平(系列倍比稀釋),最好能包含測量線性區(qū)(1)基線：其功能為消除檢測過程中背景熒光信號的干擾，確定閾值。各種儀器通常有其默認(rèn)的基線范圍，但每次試驗(yàn)時應(yīng)作微調(diào)。一般起點(diǎn)仍為儀器所默認(rèn)的第2或第3個循環(huán)起，終點(diǎn)要根據(jù)每批次實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整到最高濃度標(biāo)本擴(kuò)增曲線起跳前3～4個循環(huán)點(diǎn)處。(2)閾值線：閾值等于基線范圍內(nèi)熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，每批次試驗(yàn)時也需根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。原則為：①落在陰性質(zhì)控線最高點(diǎn)上方；②外標(biāo)準(zhǔn)曲線處于等分的位置；③盡量接近擴(kuò)增曲線剛剛進(jìn)入真正指數(shù)擴(kuò)增期的位置，這樣可有效避免弱陽性漏檢以及一些擴(kuò)增反應(yīng)干擾因子在指數(shù)期的放大，獲得最大的靈敏度和精密度。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)：包括相關(guān)系數(shù)、斜率和截距，實(shí)驗(yàn)室需根結(jié)果的穩(wěn)定性。相關(guān)系數(shù)反映的是系列標(biāo)準(zhǔn)品起始拷貝數(shù)與Cx值間的相關(guān)性，應(yīng)大于等于0.99;斜率與擴(kuò)增效率有關(guān)，斜率=1/log(1+擴(kuò)增效率),應(yīng)控制在-3.9～—3.1(擴(kuò)增效率100%、90%和80%時，斜率分別為-3.32、-3.58和-3.92);截距為原始模板趨向于0,即陰性標(biāo)本檢測的C值，如某試驗(yàn)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為40,則其截距應(yīng)在40左右。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和截距的批間變異均應(yīng)控制在5%以內(nèi)。(三)室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)的定期回顧分析統(tǒng)計和分析評價(定量試驗(yàn)陽性質(zhì)控);計算出相應(yīng)時間內(nèi)的均值、控制限進(jìn)行修改，必要時可更換質(zhì)控品或者對質(zhì)控方法進(jìn)行重新二、室間質(zhì)量評價(一)室間質(zhì)量評價參加衛(wèi)生部、省級臨床檢驗(yàn)中心等第三方機(jī)構(gòu)組織的室間質(zhì)量評價。具體要求及質(zhì)評方案為：1.實(shí)驗(yàn)室有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控措施。2.質(zhì)評標(biāo)本與常規(guī)臨床檢測標(biāo)本一起在同等條件(包括人3.質(zhì)評回報表上所要求的內(nèi)容逐項認(rèn)真填寫、審核并在規(guī)定時間內(nèi)回報。4.質(zhì)評方案目前，江蘇省的HBV-DNA質(zhì)評方案為：每年至少開展2次室間質(zhì)評活動，每次測定至少5個批號的質(zhì)控標(biāo)本。定結(jié)果落在PT方案的可接受范圍內(nèi)(log靶值±0.5),稱為可接對每次室間質(zhì)量評價活動，針對某一項目的得分計算公式為：對評價的所有項目，其得分計算公式為：每次室間質(zhì)評活動每一檢測項目得分≥80分，則該項目質(zhì)評成績合格；所有評價項目得分≥80分，則本次室間質(zhì)評成績合格。對本次未參加或在規(guī)定時間未能回報結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室，將定為不合格的質(zhì)評成績，該次活動的得分為0。(二)實(shí)驗(yàn)室間比對對沒有開展室間質(zhì)評的檢測項目，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過與其他實(shí)驗(yàn)室(如已獲認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室或其他使用相同檢測方法或檢測系統(tǒng)的同級別或高級別實(shí)驗(yàn)室)比對的方式判斷檢驗(yàn)結(jié)果的可接受性。通常所采用的方案是分割標(biāo)本檢測計劃，通過標(biāo)本的分割，將另一份或幾份的標(biāo)本送到其他實(shí)驗(yàn)室，以獲得室間比對的數(shù)據(jù)，用于分析實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的一致性及偏倚。一般情況下，每年至少2次，每次至少5個標(biāo)本，包括正常和異常標(biāo)本；判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)有≥80%的結(jié)果滿足要求。注意：用于比對的分割標(biāo)本需要保留足夠數(shù)量的備份，以便在室間比對結(jié)果出現(xiàn)差異時，可由另外的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步分析以查找原因。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室間比對不適用時，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立評估檢測結(jié)果與臨床診斷的一致性的程序，判斷結(jié)果的可接受性。每年評價不少于2次，并記錄。(三)總結(jié)與分析實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對室間質(zhì)評/室間能力比對結(jié)果進(jìn)行總結(jié)和分析，從中了解本實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)室所處的水平，如有不合格的項目，積極查找原因，并及時加以糾正。檢驗(yàn)結(jié)果的報告與說明一、檢驗(yàn)結(jié)果的審核與報告在報告患者檢驗(yàn)結(jié)果之前：①必須對質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行判斷，確認(rèn)質(zhì)控在可接受范圍；②必須對報告單進(jìn)行審核，包括操作人員對檢驗(yàn)結(jié)果的核查(如檢驗(yàn)項目有無遺漏、標(biāo)本質(zhì)量是否符合要求、結(jié)果填寫是否正確、或有無難以解釋的檢驗(yàn)結(jié)果等)和有資質(zhì)的檢驗(yàn)人員的審核(除上述內(nèi)容外，對有質(zhì)疑或異常的結(jié)果，還應(yīng)考慮與臨床診斷或其他相關(guān)檢查，或與以往結(jié)果的符合情況，結(jié)果解釋是否合理，是否需要復(fù)查或其他檢查等),從而決定檢驗(yàn)報告是否發(fā)放。報告中應(yīng)含有足夠的信息，基因診斷學(xué)報告單還需補(bǔ)充以下部分內(nèi)容：①標(biāo)本的性狀；②必要時，民族、家族或種族的信息；③必要時，患者的聯(lián)系方式；④必要的分析說明，如結(jié)果解釋或用藥建議(如檢測到的突變位點(diǎn)對靶向藥物的敏感或拮抗作用的提示),復(fù)檢及其他進(jìn)一步檢驗(yàn)的建議；⑤方法的局限性(如x%的可信限、假陽性或假陰性率)等；⑥必要時，采樣人員、標(biāo)本質(zhì)量評估人員的簽名(如組織標(biāo)本)。注意：測序圖、凝膠電泳圖和放射自顯影圖等必須有足夠高的分辨率和質(zhì)量(本底低，信號清晰、規(guī)則，無氣泡等),可確保結(jié)果的二、報告的結(jié)果說明與進(jìn)一步檢查的建議檢驗(yàn)報告所提供的結(jié)果絕大部分屬于數(shù)據(jù)資料，而非信息，信息是經(jīng)過解釋的數(shù)據(jù)，只有檢驗(yàn)信息才能為臨床提供有價值的建議。1.報告單上需要有結(jié)果解釋或用藥建議。如EGFR基因檢測19外顯子未見序列缺失、21外顯子未見點(diǎn)突變，建議：對酪氨酸激酶抑制劑治療慎用。2.與臨床交流溝通，使得臨床醫(yī)師能夠充分理解結(jié)果的報告方式和內(nèi)在含義，以及在標(biāo)本采集和臨床用藥上可能對結(jié)果的影響。3.檢驗(yàn)結(jié)果可疑或處于臨界值附近，需要復(fù)查、跟蹤觀察、或是需要了解患者的其他相關(guān)信息時，及時與臨床醫(yī)師溝通，提出4.當(dāng)檢測結(jié)果與其他檢查發(fā)現(xiàn)或臨床表現(xiàn)存在差異而受到臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范及評審驗(yàn)收臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項目是目前我國臨床檢驗(yàn)項目中唯一一項需要通過評審驗(yàn)收方可開展臨床收費(fèi)檢驗(yàn)的技術(shù)準(zhǔn)入項目。實(shí)