色譜分析導論課件

提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析抗壞血酸的生物活性

L(100%)D(無)L異(無)D異(5%)1方法原理LD異1.1混合組分的別離AE03-B萃取器1方法原理多級串聯(lián)離心萃取機〔實現(xiàn)多級串聯(lián)逆流洗滌或萃取〕1方法原理1.2色譜別離1903年俄國植物學家茨維特別離植物色素1方法原理混合色素CaCO3石油醚綠色層(葉綠素A）黃色層（葉黃素）黃色層(胡蘿卜素)洗出液1.2.1色譜別離原理P111

固定相:將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動的一相〔固體或液體〕；流動相:自上而下運動的一相〔氣體或液體〕；色譜柱:裝有固定相的管子〔玻璃管或不銹鋼管〕。1方法原理當流動相中樣品混合物經(jīng)過固定相時，會與固定相發(fā)生作用;

由于各組分在性質(zhì)和結構上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異;

在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，

各組分按先后不同的次序從固定相中流出。1方法原理1.2.2色譜法的分類

氣相色譜(GC):氣體為流動相的色譜分析方法氣固色譜(GSC)氣液色譜(GLC)液相色譜(LC):液體為流動相的色譜分析方法液固色譜〔LSC〕液液色譜(LLC)超臨界流體色譜(SFC):流動相的色譜分析方法1方法原理1方法原理流動相氣體液體方法名稱氣相色譜液相色譜固定相固體吸附劑液體固體吸附劑液體方法名稱氣-固色譜氣-液色譜液-固色譜液-液色譜1.3色譜流出曲線及有關術語P1221.3.1基線

在實驗操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應該是一條水平直線，但實際中存在漂移。1方法原理

1.3.2色譜流出曲線1方法原理色譜峰峰高:色譜峰頂點與基線之間的垂直距離峰面積:組分的流出曲線與基線所包圍的面積定量分析的主要依據(jù)

1方法原理標準偏差

對應0.607峰高的一半峰寬值半峰寬W1/2

對應0.5峰高的寬值

W1/2=2.354

峰底寬度WW=4

1方法原理

死時間tM/死體積VM

不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積。

1方法原理信號tM進樣保存時間tR/保存體積VRP123試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間或流出的體積。1方法原理信號進樣tR1.3.6調(diào)整保存時間tR//調(diào)整保存體積VR/某組分的保存時間扣除死時間后，稱為該組分的調(diào)整保存時間或流出的體積。tR′=tRtMVR′=VRVM1方法原理信號進樣tR/分配系數(shù)KP124分配色譜的別離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復屢次的分配過程，而吸附色譜的別離是基于反復屢次的吸附-脫附過程。1方法原理1.3.8分配比kP124

分配比又稱容量因子，指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比。1方法原理分配系數(shù)K與分配比k的關系

K=k.

相比率(β)反映各種色譜柱柱型特點的一個重要參數(shù)。填充柱，β值一般為6~35

毛細管柱，β值為60~6001方法原理色譜流出曲線的用途從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)；根據(jù)色譜峰的保存值，可以進行定性分析；根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；色譜峰的保存值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù)；色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相〔或流動相〕選擇是否適宜的依據(jù)。1方法原理提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析2.1塔板理論P124

把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標。色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。

2色譜別離理論在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快到達分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前移動。對于一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)：n=L/Hn:理論塔板數(shù)與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。2色譜別離理論塔板理論指出：當溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n大于50時，可得到根本對稱的峰形曲線。在色譜柱中，n值一般很大，如氣相色譜柱的n約為103~106，因而流出曲線可趨近于正態(tài)分布曲線。(2)當樣品進入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復屢次的分配平衡后，仍可獲得良好的別離。2色譜別離理論n與半峰寬及峰底寬的關系式：n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/W)2在tR一定時，如果色譜峰很窄，那么說明n越大，H越小，柱效能越高。實際上反映色譜柱的別離效能:n有效=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/W)2H有效=L/n有效2色譜別離理論例題1：某組分峰的峰底寬為40s，保存時間為400s，死時間為20s,計算此色譜柱的理論塔板數(shù)。解：n=16(tR/W)2=16(400/40)2=1600(塊)n有效=16(tR/W)2=16(380/40)2=1444(塊)2色譜別離理論2.2速率理論1956年荷蘭學者vanDeemter〔范第姆特〕等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學理論—速率理論。它吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，在動力學根底上較好地解釋了影響板高的各種因素。理論模型對氣相、液相色譜都適用。2色譜別離理論速率理論的數(shù)學簡化式P125

H=A+B/u+Cu

A:渦流擴散項〔多路效應項〕B/u:分子擴散項〔縱向擴散項〕Cu:傳質(zhì)阻力項2色譜別離理論①渦流擴散項AP125當組分在填充色譜柱中隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似渦流的流動。填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長短不一，同時進色譜柱的相同組分到達柱口時間并不一致，引起了色譜峰的變寬。2色譜別離理論氣相色譜中渦流擴散引起的峰形擴展2色譜別離理論液相色譜中渦流擴散引起的峰形擴展2色譜別離理論色譜峰變寬的程度：A=2λdPA與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)那么因子λ有關，與流動相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關。為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于空心毛細管，不存在渦流擴散,A=0。2色譜別離理論②分子擴散項B/u〔縱向擴散項〕P126由濃度梯度造成的分子擴散。組分從柱入口參加，其濃度分布的構型呈“塞子〞狀。它隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，“塞子〞必然自發(fā)的向前和向后擴散，造成譜帶展寬。分子擴散項系數(shù)B=2γDgγ是填充柱內(nèi)流動相擴散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。2色譜別離理論縱向分子擴散使峰展寬〔a〕柱內(nèi)譜帶構型〔b〕相應的響應信號2色譜別離理論（a）（b）液相色譜中分子擴散引起的峰形擴展2色譜別離理論③傳質(zhì)阻力項CuP126

氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，傳質(zhì)過程不完全相同。氣液色譜傳質(zhì)阻力系數(shù)C：氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg液相傳質(zhì)阻力系數(shù)CL

C=Cg+CL

傳質(zhì)阻力項Cu＝Cgu+CLu2色譜別離理論2.2.2液相色譜速率方程

H=HE+HL+HS+HMM

=A+B/u+Cu

HE=A

：渦流擴散項

HL＝B/u：分子擴散項

Cu

＝HS+HMM

：傳質(zhì)阻力項

HS

：固定項的傳質(zhì)阻力項

HMM

：流動項的傳質(zhì)阻力項

2色譜別離理論在液液分配色譜中，傳質(zhì)阻力系數(shù)〔C〕包含固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)〔Cs〕和流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)〔Cm〕：C=Cs＋Cm2色譜別離理論①固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)〔Cs〕2色譜別離理論液體流動相進樣后起峰形溶解在固定液表面溶質(zhì)分子達到峰的前沿樣品移出色譜柱時的峰形溶解在固定液內(nèi)部溶質(zhì)分子達到峰的后尾固定液

②流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm

流動的流動相中的傳質(zhì)阻力：mmdp2/Dm

滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力：smdp2/Dm

Cm=mmdp2/Dm+smdp2/Dm2色譜別離理論移動流動相的傳質(zhì)阻力2色譜別離理論進樣后的峰形移動流動相在固體顆粒間構成的層流樣品移出色譜柱時峰形固定相基體固定相基體滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力2色譜別離理論固體相基體進樣后的峰形

滯留流動相固定液膜樣品移出色譜柱時峰形2.3別離效能指標P127

色譜柱的總別離效能指標—別離度(R)別離度是一個綜合性指標。別離度是既能反映柱效率,又能反映選擇性的指標，稱總別離效能指標。

R<1，兩峰有局部重疊；R=1，別離程度可達98%；R=1.5，別離程度可達99.7%,作為相鄰兩組分已完全別離的標志。2色譜別離理論2.3.2影響別離度的主要因素P128別離度與柱效的關系別離度與理論塔板數(shù)的關系還受熱力學性質(zhì)的影響。固定相確定，被別離物質(zhì)對的別離度將取決于n：

(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2

增加色譜柱的長度可以提高別離度，但延長分析時間。提高別離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的柱子，通過降低板高，以提高別離度。2色譜別離理論例題2：物質(zhì)A和B在一根30.00cm長的柱上的保存時間分別為16.40min和17.63min。不被保存組分通過該柱的時間為1.30min。峰底寬度分別為1.11min和1.21min。試計算：〔1〕柱的別離度〔2〕柱的平均塔板數(shù)〔3〕到達完全別離所需的柱長度2色譜別離理論解:〔1〕柱的別離度R=2(tR2-tR1)/〔W1+W2〕R=2(17.63-16.4)/(1.11+1.21)=1.06〔2〕柱的平均塔板數(shù)n=16(tR/W)2n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2=3397n平均=〔3493+3397)/2=34452色譜別離理論〔3〕到達完全別離，R≥1.5所需的柱長度(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2解1：(1.06/1.5)2=30.0/L2L2=60cm解2：n2=3445(1.5/1.06)2=6898L2=n×H=6898(30.0/3445)=60cm2色譜別離理論

2.2.2對板高的影響因素(1)流動相線速度對板高的影響P131LC和GC的H—u圖相似對應某一流速都有一個板高的極小值;

極小值就是柱效最高點。

LC板高極小值比GC的極小值小一個數(shù)量級以上，說明液相色譜的柱效比氣相色譜高得多。2色譜別離理論(2)分子擴散項和傳質(zhì)阻力項對板高的影響較低線速時，分子擴散項起主要作用較高線速時，傳質(zhì)阻力項起主要作用高線速度時，固定相傳質(zhì)阻力項成為影響板高的主要因素，隨著速度增高，板高值越來越大，柱效急劇下降；流動相傳質(zhì)阻力項對板高的奉獻幾乎是一個定值。2色譜別離理論(3)固定相粒度大小對板高的影響

粒度越細，板高越小，受線速度影響亦小，這是HPLC中采用細顆粒作固定相的根據(jù)。固定相顆粒愈細，柱流速愈慢。只有采取高壓技術，流動相流速才能符合實驗要求。2色譜別離理論提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析提綱方法原理色譜別離理論色譜定性定量分析3.1色譜的定性分析P133各種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保存值，可作為一種定性指標。目前色譜定性方法都是基于保存值。但是不同物質(zhì)在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保存值，即保存值并非專屬的。因此僅根據(jù)保存值對一個完全未知的樣品定性是困難的。在了解樣品的來源、性質(zhì)、分析目的的根底上，對樣品組成作初步的判斷，結合以下的方法那么可確定色譜峰所代表的化合物。3色譜定性定量分析保存指數(shù)法又稱為柯瓦〔Kováts〕指數(shù)，它表示物質(zhì)在固定液上的保存行為，是目前使用最廣泛并被國際上公認的定性指標。

具有重現(xiàn)性好、標準統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點。保存指數(shù)是把正構烷烴中某兩個組分的調(diào)整保存值的對數(shù)作為相對的尺度，并假定正構烷烴的保存指數(shù)為n100。被測物的保存指數(shù)值可用內(nèi)插法計算。3色譜定性定量分析

3色譜定性定量分析保存指數(shù)的意義：與被測物質(zhì)具有相同調(diào)整保存時間的假想的正構烷烴的碳數(shù)乘以100；保存指數(shù)僅與固定相的性質(zhì)、柱溫有關，與其它實驗條件無關；其準確度和重現(xiàn)性都很好。只要柱溫與固定相相同，就可用文獻值進行鑒定，而不必用純物質(zhì)相對照。3色譜定性定量分析3.2色譜定量分析P1333.2.1定量依據(jù)當操作條件一致時，被測組分的質(zhì)量(或濃度)與檢測器給出的響應信號成正比。即：

mi=fi×Aimi=fi×hi

式中mi為被測組分i的質(zhì)量；Ai為被測組分i的峰面積；

fi為被測組分i的校正因子。3色譜定性定量分析色譜定量分析的過程準確測量檢測器的響應信號—峰面積或峰高；準確求得比例常數(shù)—校正因子；正確選擇適宜的定量計算方法，將測得的峰面積或峰高換算為組分的百分含量。3色譜定性定量分析3.2.3峰面積的測量對稱形峰面積的測量—峰高乘以半峰寬法

A=1.065hW1/2(2)不對稱形峰面積的測量—峰高乘平均峰寬法不對稱峰的測量采用峰高乘以半峰寬，誤差就較大，因此采用峰高乘平均峰寬法。

A=h×(W0.15+W0.85)/23色譜定性定量分析3.2.4定量校正因子峰面積的大小不僅取決于組分的質(zhì)量，而且還與它的性質(zhì)有關。兩個質(zhì)量相同的不同組分在相同條件下使用同一檢測器進行測定時，所得的峰面積卻不相同。因此，混合物中某一組分的百分含量并不等于該組分的峰面積在各組分峰面積總和中所占的百分率。不能直接利用峰面積計算物質(zhì)的含量。為了使峰面積能真實反映出物質(zhì)的質(zhì)量，就要對峰面積進行校正，需要引入校正因子。3色譜定性定量分析絕對校正因子：fi=mi/Aifi值與組分i的質(zhì)量絕對值成正比，所以稱為絕對校正因子。在定量分析時要精確求出fi值是比較困難：精確測量絕對進樣量困難；峰面積與色譜條件有關，要保持測定fi值時的色譜條件相同，既不可能又不方便；即便能夠得到準確的fi值，也由于沒有統(tǒng)一的標準而無法直接應用。3色譜定性定量分析(2)相對校正因子①相對校正因子的定義

fi=fi/fs

即某組分i的相對校正因子fi為組分i與標準物質(zhì)s的絕對校正因子之比。

fi=(mi/Ai)/(ms/As)=(mi/ms).(As/Ai)3色譜定性定量分析②相對校正因子的測定方法相對校正因子值只與被測物和標準物以及檢測器的類型有關，而與操作條件無關。因此，fi值可自文獻中查出引用。文獻中查不到所需的fi值，也可以自己測定。常用的標準物質(zhì)苯：熱導檢測器〔TCD〕正庚烷：氫焰檢測器〔FID〕測定相對校正因子最好是用色譜純試劑。假設無純品，也要確知該物質(zhì)的百分含量。測定時首先準確稱量標準物質(zhì)和待測物，然后將它們混合均勻進樣，分別測出其峰面積，再進行計算。3色譜定性定量分析定量分析方法P135

歸一化法

把所有出峰組分的含量之和按100%計的定量方法稱為歸一化法。其計算公式如下：

3色譜定性定量分析歸一化法的優(yōu)點是簡單、準確，操作條件變化時對定量結果影響不大。在實際工作中仍有一些限制:

樣品的所有組分必須全部流出，且出峰。某些不需要定量的組分也必須測出其峰面積及fi

值；測量低含量尤其是微量雜質(zhì)時，誤差較大。3色譜定性定量分析例題3：在一個苯系混合物液中，用氣相色譜法分析，獲得如下數(shù)據(jù)，計算各組分的含量。3色譜定性定量分析組分苯甲苯鄰二甲苯對二甲苯間二甲苯fi0.7800.7940.8400.8120.801h/cm4.203.067.502.981.67W1/2/cm0.150.160.170.180.19解：P苯=1.065×

0.780×4.20×0.15=0.523A=1.065×0.780×4.20×0.15+1.065×0.794×

3.06×0.16+1.