分子病理技術(shù)課件

分子病理技術(shù)

一、概論

二、免疫組化

三、原位雜交

四、原位PCR（在實(shí)驗細(xì)胞學(xué)中講述）

五、原位末端標(biāo)記技術(shù)

（在細(xì)胞凋亡檢測方法中講）

六、組織芯片技術(shù)（李楊）

七、納米技術(shù)（原子力顯微鏡）復(fù)習(xí)題1什么是分子病理學(xué)？常用分子病理技術(shù)有哪些？2什么是免疫組織化學(xué)？試述免疫酶組織化學(xué)的方法和原理。

一、概論

生物高新技術(shù)——病理學(xué)中的應(yīng)用

向二方面發(fā)展：

計算機(jī)和圖像分析技術(shù)的應(yīng)用

簡單的形態(tài)描述——量化方面發(fā)展

直接觀察——遠(yuǎn)程遠(yuǎn)輸“間接”觀察

定量病理學(xué)和遠(yuǎn)程病理學(xué)

原位雜交、原位PCR和原位末端標(biāo)記技術(shù)

分子病理學(xué)水平

近些年來，尤其是納米技術(shù)的誕生

使人們對疾病的認(rèn)識達(dá)原子水平分子病理學(xué)

從分子水平研究患病機(jī)體生命現(xiàn)象的科學(xué)

從分子水平研究疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸機(jī)制的科學(xué)

分子生物學(xué)

細(xì)胞生物學(xué)互相滲透、交叉

經(jīng)典病理學(xué)

分子病理學(xué)的形成是分子生物學(xué)技術(shù)在病理學(xué)中的應(yīng)用的具體體現(xiàn)。

技術(shù)手段

（1）分子免疫學(xué)+病理學(xué)乃至形態(tài)科學(xué)-—

免疫組織化學(xué)

（2）分子生物學(xué)技術(shù)

（探針；PCR；分子雜交）+形態(tài)學(xué)科

ISH、ISPCR和原位末端標(biāo)記技術(shù)

(3)生物芯片技術(shù)—組織芯片技術(shù)

(4)納米技術(shù)—對疾病的認(rèn)識達(dá)原子水平

研究內(nèi)容--闡明疾病的病理機(jī)理

（1）“大海撈針”式探討單個致病基因與疾病關(guān)系研究—人類基因組計劃

（2）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)—疾病關(guān)系

認(rèn)清疾病發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

最終闡明其機(jī)制

尋求干預(yù)和防治疾病

病理學(xué)發(fā)展以方法為先導(dǎo)

人類科學(xué)進(jìn)步的歷史和學(xué)科的發(fā)展——

以研究方法與工具創(chuàng)新為先導(dǎo)

一項新技術(shù)的創(chuàng)立，隨之帶來一批新的研究成果

在病理學(xué)領(lǐng)域中

系統(tǒng)解剖—LM—EM—免疫組化技術(shù)

器官病理學(xué)—細(xì)胞病理學(xué)—免疫病理學(xué)原位雜交和原位PCR技術(shù)的興起，又將病理學(xué)這門有著悠久歷史的學(xué)科推進(jìn)到分子病理學(xué)水平

21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)

分子生物學(xué)是生命科學(xué)的帶頭學(xué)科

隨著生物高新技術(shù)在病理學(xué)中應(yīng)用的不斷增多，分子病理學(xué)將在此研究領(lǐng)域中占有越來越重要的位置免疫組織化學(xué)技術(shù)

一、概論：概念

二、方法和原理

三、免疫組織化學(xué)方法基本步驟

四、免疫組化染色的一般注意事項一、概論

1.概念：

1）免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）

是組織學(xué)的分支，它是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進(jìn)行組織原位的顯示；是免疫學(xué)與組織化學(xué)相互滲透、相互交叉而產(chǎn)生的一門學(xué)科。

2）免疫組化技術(shù)

是在組織細(xì)胞原位檢測抗原（或抗體）的一種方法，也是在蛋白水平原位檢測基因表達(dá)的一種方法。2.歷史

1914年，Coons等人首次用熒光素標(biāo)記抗體檢測肺炎雙球菌的成功，開創(chuàng)了免疫組化的新時代

Sternberger改進(jìn)并建立了辣根過氧化物酶－抗過氧化物酶（PAP）技術(shù)。

80年代以后，ABC、APAAP、LSAB法等，使免疫組化技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛，成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能、代謝等綜合研究的一種有力工具。

近些年來，由于原位雜交技術(shù)、流式細(xì)胞儀及圖像分析等技術(shù)的興起和應(yīng)用，使免疫組化引向基因水平和定量檢測

形成免疫組化新的分支

雜交免疫組化和定量免疫組化。

90年代初,原位PCR技術(shù)的誕生

免疫組化主要是用來原位PCR結(jié)果的化學(xué)放大和顯示，標(biāo)志著免疫組化技術(shù)又進(jìn)入了一個新的發(fā)展階段。

二、方法和原理

1.按標(biāo)記物種類分:

免疫熒光法

免疫酶法

免疫鐵蛋白法

免疫金法及放射免疫自顯影法2.按標(biāo)記物標(biāo)記的部位分

直按法（一步法）

間接法（二步法）

橋聯(lián)法（多步法）

目前應(yīng)用最為廣泛的為免疫酶法

根據(jù)三抗、酶的不同又分為

PAP法、APAAP法、BA法

ABC法、LSAB法和SP法等。

3.免疫熒光法

已知的抗體或抗原分子標(biāo)記上熒光素

與其相對應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)

形成的免疫復(fù)合物上帶有一定量的熒光素

熒光顯微鏡下——熒光的抗原抗體結(jié)合部位

檢測出抗原或抗體直接法免疫熒光原理示意圖間接法免疫熒光原理示意圖4.免疫酶組織化學(xué)

60年代初，HRP-抗體分子上，開創(chuàng)了酶標(biāo)記抗體的新技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用。目前應(yīng)用最廣泛的酶是HRP，其次是AP。

（1）PAP法Ag→Ab1→Ab2→PAP→DAB

其靈敏度是免疫熒光法的100-1000倍

（2）ABC法:Ag→Ab1→Bio-Ab2→ABC→DAB

（3)APAAP法:

Ag→Ab1→Ab2→APAAP→FR

（4）LSAB或SP法:

Ag→Ab1→Bio-Ab2→HRP-SADAB

（AP-SA）→（FR/NBT）直接法免疫酶組織化學(xué)原理示意圖間接法免疫酶組織化學(xué)原理示意圖AgAgAb1Ab2Ab1Bio-Ab2LSABABCPAPAPAAPHRP-DABAP-堅固紅NBT多步法免疫酶組織化學(xué)原理示意圖三、免疫組織化學(xué)方法基本步驟

1.試劑配制

（1）檸檬酸鹽緩沖液

（2）TBS(Tris

緩沖生理鹽水)

（3）

1MTris-HCl

緩沖液(pH7.4)

（4）顯色液:

（5）Mayer蘇木精復(fù)染液2.染色步驟

（1）石蠟切片脫蠟至蒸餾水；

（2）消化暴露抗原：

（3）去除內(nèi)源性酶

（4）滴加適當(dāng)稀釋的一抗；

（5）滴加適當(dāng)稀釋的生物素化的二抗；

（6）滴加ABC復(fù)合物等三抗；

（7）滴加底物顯色；

（8）蘇木素復(fù)染核，脫水透明封片。

以上(1)-(5)之間均用緩沖液洗。

3.結(jié)果判定

HRP-DAB:陽性呈棕黃或棕黑色

AP-Fastred:玫瑰紅色

AP-NBT,BCIP:紫藍(lán)色HRP-DAB:棕黃或棕黑色AP-Fastred:玫瑰紅色4.對照實(shí)驗

（1）空白對照：一抗由TBS

或其他無關(guān)抗體取代。

（2）陰性對照：二抗和/或三抗一抗

由TBS或其他無關(guān)抗體取代。

（3）陽性對照：用含已知靶抗原的切片

作陽性對照。四、免疫組化染色的一般注意事項

1.內(nèi)源酶的滅活及內(nèi)源生物素的處理

HRP—3％的H2O2水溶液

含豐富血細(xì)胞的標(biāo)本中，與H2O2產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng)，出現(xiàn)冒泡而破壞組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。

可以用3％的H2O2甲醇液內(nèi)源性生物素的去除：

目的：正常細(xì)胞也含有生物素，尤以肝、脾、腎組織含量為多。在應(yīng)用親和素試劑的染色中，內(nèi)源性生物素易結(jié)合后繼抗體，形成親和素(或鏈親合素)-生物素復(fù)合物，導(dǎo)致假陽性發(fā)生。

方法：在采用生物素方法染色前，對標(biāo)本進(jìn)行親和素處理，使其結(jié)合位點(diǎn)飽和。2.消除非特異性背景著色

常見于蛋白質(zhì)(抗體)吸附到組織切片中高度荷電的膠原及結(jié)締組織成分上。

方法：在滴加一抗前在標(biāo)本上加一種無關(guān)的蛋白質(zhì)溶液，以封閉荷電點(diǎn)不給一抗留有吸附的余地，以保證一抗不會吸附到膠原纖維及結(jié)締組織成分上。

最常用的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液是產(chǎn)生二抗的同種動物的非免疫血清。3.緩沖液的選擇

目的：保證免疫組織化學(xué)染色的最佳條件，即合適的離子濃度和pH值。

但不同的酶促反應(yīng)要求不同的pH值和不同的離子。

HRP免疫組織化學(xué)染色需近中性環(huán)境，pH7.4-7.6較為合適。

AP--需選堿性緩沖液，pH8.2較為合適。4.抗原修復(fù)

目的

石蠟切片,甲醛固定，使抗原性物質(zhì)或由于形成醛鍵、羧甲鍵等原因而被封閉了部分抗原決定簇；或由于蛋白之間發(fā)交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽.

在染色時，有些抗原需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露。方法

（1）化學(xué)方法：酶--抗原決定蔟暴露

胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等

（2）物理/化學(xué)方法：主要有

單純加熱方法：檸檬酸鹽緩沖液

高壓加熱方法：

微波方法：利用熱效應(yīng)和微波的直接作用，打開蛋白之間的交聯(lián)鍵，將已被封閉的抗原決定簇暴露和修復(fù)。5.一抗的選用、稀釋度及孵育時間

一抗是免疫組織化學(xué)染色中最重要的試劑

抗體工作稀釋度取決于：

①特異性抗體的濃度，即滴度；

②抗體的純度；

孵育時間：特異性染色較強(qiáng)且無背景著色，是較理想的稀釋度。加長孵育時間可有效地降低所用抗體的濃度，有利于提高染色質(zhì)量，節(jié)省抗體

室溫過夜是較好的方法，但也可用37℃1小時或4℃過夜的方法。6.選擇適宜的檢測方法

血涂片，骨髓涂片–內(nèi)源性HRP豐富

APAAP或堿磷酶標(biāo)記的方法

肝、腎等組織——內(nèi)源性生物素豐富

PAP方法

一般的免疫組化—ABC和SP7.顯色中的一些問題

顯色的停止點(diǎn)：目的物達(dá)最深染色而背景無著色。顯色時間過短，著色過淺；顯色時間過長，背景著色又過深，都將影響結(jié)果的判斷，均應(yīng)避免。

通常顯色結(jié)果以陽性對照得出最佳結(jié)果的時間為標(biāo)準(zhǔn)。

納米技術(shù)

物質(zhì)基礎(chǔ)：原子力顯微鏡

納米技術(shù)、信息技術(shù)和生物技術(shù)----

21世紀(jì)社會發(fā)展的三大支柱

我國—啟動

01.6.29,科技部和中科院—“沈陽材料科學(xué)

國家（聯(lián)合）實(shí)驗室”。這一裝備先進(jìn)

的實(shí)驗室將主攻納米級材料

01.7（3-5),國際納米材料項目論壇會議上，

科技部將斥資10億—支持國家納米技術(shù)，

資金在5年內(nèi)全部到位

納米技術(shù)--在10-7-10-9m范圍內(nèi)，對物質(zhì)內(nèi)原子、分子的運(yùn)動和變化進(jìn)行研究、操縱和加工的技術(shù)。

納米（nm）也即10-9m。納米技術(shù)的誕生，使人們認(rèn)識事物的本質(zhì)和變化規(guī)律達(dá)原子水平。納米技術(shù)最早在材料科學(xué)中應(yīng)用

目前已取得了較大進(jìn)