分子病理檢測平臺原位雜交課件

分子病理檢測平臺

------原位雜交病理科1分子病理檢測平臺

------原位雜交原理及實驗過程原位雜交的應用1.EBER2.HPV3.Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應用1.實體性腫瘤2.淋巴造血系統腫瘤3.產前診斷22原位雜交原理核酸分子雜交（nucleicacidhybirdzation）：指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互補配對原則形成雙鏈的過程。雜交雙方分別為待檢的核酸序列和已知的核酸序列，后者常用核素和非核素示蹤標記，稱為探針（probe），雜交后形成異源性雙鏈分子稱為雜交體。生命科學的“釣魚”。3原位雜交原理核酸分子雜交（nucleicacidhybi44DNA將探針置于載玻片上制片雜交變性檢測在熒光顯微鏡下觀察5DNA將探針置于載玻片上制片雜交變性檢測在熒光顯微鏡下觀察5原位雜交原理及實驗過程原位雜交的應用1.EBER2.HPV3.Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應用1.實體性腫瘤2.淋巴造血系統腫瘤3.產前診斷66普通原位雜交（ISH）用途：檢測DNA及RNA表達的情況，輔助病學學診斷檢測項目：1.EBV病原EBER原位雜交檢測2.HPV病原體低危6/11和高危16/18原位雜交檢測3.Kappa和lambda克隆性分析原位雜交法檢測檢測結果分析：僅為細胞核著色。只有當核分裂時可以出現細胞質陽性著色。7普通原位雜交（ISH）用途：檢測DNA及RNA表達的情

1、EBER檢測：潛伏性EBV感染與幾種情況相關：鼻咽癌、淋巴組織疾病（霍奇金淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、NK/T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞淋巴瘤、腸病T細胞淋巴瘤、免疫抑制劑患者淋巴瘤、淋巴樣肉芽腫、傳染性單核細胞增多癥等）。一旦感染EBV，受感染者終身帶病毒。EBV具有感染和轉化B細胞特性，能使小淋巴細胞轉變成永生的類淋巴母細胞的特征。8

8992、HPV檢測：HPV感染與生殖器疣、宮頸癌相關（12個低危型、15個高危型）。HPV原位雜交檢測；低危HPV6/11、高危16/18型。102、HPV檢測：103.Kappa及Lambda檢測輕鏈限制性或者單克隆性可用于區(qū)分B細胞反應性增殖和腫瘤性增殖。113.Kappa及Lambda檢測11原位雜交原理及實驗過程原位雜交的應用1.EBER2.HPV3.Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應用1.實體性腫瘤2.淋巴造血系統腫瘤3.產前診斷1212131314141515FISH探針種類16FISH探針種類16FISH探針種類17FISH探針種類1718181919原位雜交原理及實驗過程原位雜交的應用1.EBER2.HPV3.Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應用1.實體性腫瘤2.淋巴造血系統腫瘤3.產前診斷2020熒光原位雜交（FISH）原理：通過熒光標記的DNA探針與細胞核內的DNA靶序列雜交用途：檢測基因異常1.基因片段擴增

2.基因片段缺失

3.基因片段易位FISH技術的應用：1.靶向藥物篩選2.危險人群篩查3.風險預測分析4.輔助診斷21熒光原位雜交（FISH）21FISH檢測項目1.實體性腫瘤Her-2基因檢測，指導Herceptin分子靶點的治療；EGFR基因擴增檢測，指導肺癌、腸癌分子靶點治療；ALK基因易位檢測，指導肺癌分子靶點治療；檢測尿脫落細胞染色體非整倍性，用于膀胱癌的診斷、復發(fā)判斷；檢測宮頸癌腫瘤細胞TERC基因擴增，判斷CIN病變的演進風險等。2.淋巴造血系統疾病淋巴瘤診斷分型，檢測特異染色體易位，協助淋巴瘤分類；慢性粒細胞白血病等白血病及多發(fā)性骨髓瘤FISH檢測，判斷預后等。3.產前診斷唐氏綜合癥（21三體）等產前染色體數目檢測，協助產前診斷。22FISH檢測項目1.實體性腫瘤22計數細胞必須是各通道信號均清晰可辨的細胞，細胞核輪廓不清或有重疊的不要分析。雜交不均勻的區(qū)域不要分析。背景深影響信號判斷的區(qū)域不要分析。在分析石蠟切片時，分析的區(qū)域應在腫瘤細胞集中的部位（需由病理科醫(yī)師認定）如果超過25％的細胞核內信號太弱，則該區(qū)域不要進行分析。如果超過10％的細胞質內有信號，則該區(qū)域不要進行分析。結果判讀、分析

23計數細胞必須是各通道信號均清晰可辨的細胞，細胞核輪廓不清或有FISH結果觀察流程觀察程序：首先在HE染色切片上確認癌細胞區(qū)域；然后在10×物鏡下，于FISH標本上找到與HE染色切片上相同的組織細胞結構，仔細觀察信號；在40×物鏡下掃描整張切片，觀察是否存在表達的異質性，以及標本的質量，滿意的標本應是75%以上癌細胞核中都有雜交信號；在100×物鏡下觀察癌細胞核的FISH結果并進行信號計數和比值計算。24FISH結果觀察流程觀察程序：24實體腫瘤FISH應用25實體腫瘤FISH應用251.乳腺癌Her-2/neu基因擴增檢測261.乳腺癌Her-2/neu基因擴增檢測2627272828HER2/CEN-171.8-2.2臨界需重新再進行另外20個的細胞計數或重新FISH檢測，如仍不確定，則建議臨床結合IHC檢測HER2蛋白表達情況決定是否使用靶向治療。CEN-17多體性：計數20個細胞內綠信號的均值。CEN-17均值<1.75亞二體性CEN-17均值1.76-2.25二體性CEN-17均值2.26-3.75低多體性CEN-17均值>3.76高多體性29HER2/CEN-171.8-2.2臨界29石蠟切片（ASCO/CAP2013指南）計數至少30個細胞，統計Ratio值（Ratio值＝30個細胞核中紅/綠）。

Ratio≥2.0或者＜2.0但HER-2信號數為≥6.0，結果為陽性，提示基因擴增；

Ratio＜2.0且HER-2信號數＜4.0為陰性結果，提示樣本無基因擴增；

Ratio＜2.0且4.0≤HER-2信號數＜6.0時結果為不確定，可以選擇增加計數細胞至100個,或重做FISH實驗來判斷最終結果。若紅信號明顯成簇或成團，判斷為擴增。乳腺癌HER-2FISH評分標準30石蠟切片（ASCO/CAP2013指南）乳腺癌HER-23131323233333434353536362.胃癌Her-2/neu基因擴增檢測372.胃癌Her-2/neu基因擴增檢測373838胃癌HER-2FISH評分標準胃癌HER-2檢測指南：計數至少30個細胞，統計Ratio值（Ratio值＝30個細胞核中紅/綠）。

Ratio≥2.2或者HER-2信號簇狀，結果為陽性，提示基因擴增；

Ratio＜1.8為陰性結果，提示樣本無基因擴增；

Ratio在1.8-2.2時，選擇增加計數細胞至100個,若Ratio≥2.0，判斷為陽性，若Ratio<2.0，判斷為陰性。必要時重做FISH實驗來判斷最終結果。39胃癌HER-2FISH評分標準胃癌HER-2檢測指南：3940403.肺癌EML4-ALK基因融和檢測413.肺癌EML4-ALK基因融和檢測4142424343肺癌EML4-ALK檢測指南：計數至少50個腫瘤細胞1.無ALK基因斷裂的腫瘤細胞中，橘紅色和綠色重疊為黃色或者相互粘合（兩個信號之間的間隔小于兩個信號的直徑）；2.在ALK基因斷裂的腫瘤細胞中，橘紅色和綠色分離（兩個信號之間的間隔大于兩個信號的直徑），如果50個肺癌細胞中至少有25個存在分離信號，則為ALK

FISH陽性；3.在ALK基因斷裂的腫瘤細胞中，橘紅色和綠色分離（兩個信號之間的間隔大于兩個信號的直徑），如果50個肺癌細胞中分離信號為5—25個，則需重復計數50個細胞，累計100個細胞中超過15個存在分離信號（〉=15%）則為ALK

FISH陽性；肺癌EML4-ALK

FISH評分標準44肺癌EML4-ALK檢測指南：肺癌EML4-ALKFISH454546464747484849494.其他實體腫瘤FISH應用1.TOP2A/CSP17(乳腺癌)：指導化療藥物蒽環(huán)類應用2.EGFR/CDP17(肺癌)：指導靶向藥物應用3.C-MET(肺癌)：指導靶向藥物的應用4.TERC/CSP3

(宮頸癌)：判斷CIN病變的演進風險分級，早診5.CSP3/CSP7、P16/CSP17(膀胱癌)：膀胱癌的早診、復發(fā)判斷；6.PTEN/CEN10、FGFR1/CEN8、ERG（前列腺癌）：判斷預后、早診7.1p36/1p25、19q13/19p13、N-Myc/2q11（神經母細胞瘤、神經膠質瘤）：輔助診斷、判斷預后、指導化療方案應用、8.

PTEN/CEN10（黑色素瘤）：指導藥物治療、判斷預后9.CCND1/CEN11、MDM2/CEN12（間質瘤）：判斷預后10.SYT(滑膜肉瘤)：輔助診斷11.EWS(尤文肉瘤)：輔助診斷12.FKHR(橫紋肌肉瘤)：輔助診斷13.MDM2(脂肪肉瘤)：輔助診斷504.其他實體腫瘤FISH應用1.TOP2A/CSP17(5151返回52返回5253535454返回55返回555656返回57返回575858返回59返回596060返回61返回6162626363返回64返回64返回65返回65返回66返回66返回67返回67返回68返回68血液病FISH應用69血液病FISH應用69目前常見的淋巴瘤染色體易位檢測IGH/BCL6t(3;14)t(3;22)t（2；3）染色體易位-彌漫性大B細胞淋巴瘤IGH/BCL2t(14;18)(q32;q21)染色體易位-濾泡性淋巴瘤IGH/MYCt(8;14)(q24;q32)染色體易位-Burkitt’s淋巴瘤IGH/CCND1t(11;14)(q13;q32)染色體易位-套細胞淋巴瘤API2/MALT1t(11;18)(q21;q21)染色體易位-粘膜相關淋巴瘤IGH/MALT1t(14;18)(q32;q21)染色體易位-粘膜相關淋巴瘤BCR/ABLt(9;22)染色體易位-慢性粒細胞性白血病PM