蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化

蛋白質(zhì)凍融蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化凍融過程到底發(fā)生了什么？低溫生物學(xué)化學(xué)熱動(dòng)力學(xué)晶體學(xué)凍融脅迫的產(chǎn)生凍融保護(hù)蛋白質(zhì)凍融蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化冰晶濃度差異在靜置情況下融化，往往會(huì)看到溶液分層情況肉眼能觀察到的凍融現(xiàn)象不均勻的體系變化蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化融解工藝上有不同升溫速率Slowwarming1-5℃/min：室溫或自來水搖intermediatewarming＞5℃/min：37℃或以上的水浴目前常用的凍融工藝步驟冷卻cooling冷凍freezing等溫保持蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化溫度意義設(shè)備生物樣品存儲(chǔ)應(yīng)用

0～-600C為組織和細(xì)胞內(nèi)水的結(jié)晶溫度，溫度進(jìn)入此范圍組織內(nèi)的水開始結(jié)晶傷害細(xì)胞和組織微觀結(jié)構(gòu)。各種冷凍冰箱可中長期保持經(jīng)過提純的生物大分子的穩(wěn)定性，但不能存保持組織中的生物大分子穩(wěn)定性、細(xì)胞活性及組織微觀結(jié)構(gòu)。-800C為水的結(jié)晶溫度之下較為安全的溫度，同時(shí)樣本內(nèi)的生化反應(yīng)顯著減弱。也是目前自動(dòng)化存儲(chǔ)設(shè)備所能使用的最低溫度。超低溫冰箱可中期保持組織內(nèi)生物大分子的穩(wěn)定性；短期保持細(xì)胞活性和組織微觀結(jié)構(gòu)。-1360C為水的玻璃化溫度，水的結(jié)晶對(duì)細(xì)胞和組織不再有明顯傷害，樣本內(nèi)的各種生化反應(yīng)幾近停止。液氮箱/罐氣相；

深冷冰箱可中長期保持組織內(nèi)生物大分子、細(xì)胞和組織微觀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為不少樣本庫推薦用于長期凍存組織。-1960C為液氮蒸發(fā)的溫度，是常規(guī)方法所能實(shí)現(xiàn)的最低溫度。樣本內(nèi)的各種生化反應(yīng)可以認(rèn)為停止，水的結(jié)晶對(duì)細(xì)胞和微觀組織的傷害可以忽略。液氮箱/罐液相可長期保持組織中的生物大分子穩(wěn)定性、細(xì)胞活性及組織微觀結(jié)構(gòu)，但對(duì)存儲(chǔ)耗材有較高要求。生物樣品常用存儲(chǔ)溫度蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化一、物理脅迫低溫變性冷凍濃縮效應(yīng)冰晶形成二、化學(xué)脅迫冷凍脅迫蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化低溫變性效應(yīng)通常發(fā)生在0℃下，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)解折疊蛋白質(zhì)的吉布斯自由能隨溫度變化趨勢認(rèn)為跟溫度下疏水殘基的溶解度增加變性溫度與pH、蛋白濃度、添加劑(如糖、離液劑等)有關(guān)低鹽低溫β-lactoglobulinchymotrypsinogenlactatedehydrogenasemyoglobinphosphoglyceratekinaseribonucleaseandstaphylococcalnuclease蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化冷凍過程中的溫度變化蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化溶質(zhì)濃度與粘度升高溶質(zhì)重新分布溶質(zhì)結(jié)晶（過飽和）pH變化相分離2.冷凍濃縮效應(yīng)蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化Figure2.Temperature,%soluteconcentration,andviscosityprofilesasafunctionoftemperatureduringfreezingof3%sucrose.Thedatawerecalculatedbyassumingicecrystallizationoccursat?15°Candthatthesolutioncompositionfollowstheequilibriumfreezingpointdepressioncurve.TheviscositieswereestimatedfromafitofviscositydataoverawiderangeofcompositionandtemperaturetoaVogel-Tammann-Fulcher-typeequation.DatatakenfromReference7(1)溶質(zhì)濃度與粘度升高，溶質(zhì)重分布引起反應(yīng)速率發(fā)生改變冰-水界面上形成濃度梯度蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化(2)pH變化酸變堿或堿變酸的pH巨大變化都是可能的溶質(zhì)結(jié)晶一般發(fā)生在低濃度溶質(zhì)中，原因可能在于離子在冰與水之中遷移，不同離子遷移性質(zhì)與速率不同KH2PO4不容易析出Na2HPO4過飽和析出KH2PO4-Na2HPO4-H2O系統(tǒng)中KCl引起pH升高，＞6NaCl引起pH降低，＜4Ref:ProteinStabilityDuringFreezing，SeparationofStressesandMechanismsofProteinStabilization蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化沒食子酸GallicAcid在有NaCl存在時(shí)凍融發(fā)生分解分解反應(yīng)發(fā)生只在堿性溶液中，酸性環(huán)境基本不發(fā)生提供一種思路：不添加堿性試劑的前提下，從中性或酸性環(huán)境下催化堿性反應(yīng)。蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化共晶點(diǎn)：-16.7℃即使共晶點(diǎn)以下，溶質(zhì)擴(kuò)散還在發(fā)生沒食子酸在長期保存時(shí)濃度發(fā)生的變化蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化重組血紅蛋白hemoglobin在PEG-Dextran系統(tǒng)中的相圖混合液7%PEG7%Dextran頂層10%PEG0.2%Dextran底層2%PEG20%Dextran(3)相分離現(xiàn)象誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷蛋白質(zhì)分配進(jìn)兩種相中，可能使穩(wěn)定劑失去保護(hù)作用改變穩(wěn)定所需的分子間相互作用形成兩相界面（在不完全分離體系中，蛋白質(zhì)大面積暴露）可發(fā)生于電解質(zhì)-聚合物聚合物-聚合物聚合物-多糖蛋白質(zhì)-多糖蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-表面活性劑糖-蛋白質(zhì)-多糖電解質(zhì)-聚合物-多糖存在相分離現(xiàn)象PEG/PVP-DextranPVP-ficollPEG-磷酸鹽蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化3.冰晶形成(1)冰晶生長→冷凍濃縮(2)冰水界面界面有可能是疏水性的，發(fā)生吸附變性離子遷移性質(zhì)不同，產(chǎn)生電勢(3)結(jié)冰時(shí)，蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列，為熵增提供了熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力，產(chǎn)生吸附和解折疊。結(jié)冰后水分子與蛋白質(zhì)分子距離發(fā)生改變，肽鏈發(fā)生拉扯，改變氫鍵、靜電、范德華力及疏水作用。(4)組織結(jié)構(gòu)破壞快的冷卻速率(小體積到液氮)：往往形成大量小冰晶，更多的冰水界面蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化化學(xué)脅迫1.增強(qiáng)—NH2的羥胺反應(yīng)2.共價(jià)聚合3.影響反應(yīng)平衡ReactionsinFrozenSystems.JournaloftheAmericanChemicalSociety蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化凍融保護(hù)/低溫保護(hù)樣品濃度冷凍降溫/融化升溫速率3.保護(hù)劑蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化2.凍融時(shí)的溫度變化速率對(duì)活性恢復(fù)的影響蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化3.保護(hù)劑舉例：過氧化氫酶活性影響蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化低溫/凍融保護(hù)劑種類：聚合物類PVP/PEG在凍結(jié)過程中優(yōu)先析出；具有一定的表面活性；提高溶液粘度；顯著提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度；抑制溶液pH的降低?？梢云鸬蜏乇Ｗo(hù)劑和脫水保護(hù)劑作用。多元醇甘油/DMSO/乙二醇強(qiáng)烈結(jié)合水分子，很強(qiáng)持水性，可與蛋白質(zhì)形成氫鍵取代水，保證蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。但甘油濃度提高至一定程度時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用能力可能達(dá)到了極限。滲入性保護(hù)劑糖類蔗糖/海藻糖非滲入性保護(hù)劑，蔗糖在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，從而減緩晶核的生長過程，使形成的冰晶較細(xì)小，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。表面活性劑改善冰晶的吸附，既能在凍結(jié)和脫水過程中降低冰-水界面張力所引起的凍結(jié)和脫水變性，又能在復(fù)水過程中對(duì)表面活性劑組分起到潤濕劑和重褶皺劑的作用蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化蔗糖縮短相變過程的時(shí)間蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化NaCl濃度的影響蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化學(xué)變化Glycine在磷酸緩沖液中的保護(hù)作用顯著影響磷酸緩沖液在凍融時(shí)的pH變化0-50mM降低成核速率，減少磷酸鹽的結(jié)晶，pH會(huì)有升高＞100mM促進(jìn)鹽的結(jié)晶，pH降低蛋白質(zhì)凍融過程中的物理化