免疫檢測(cè)法及其應(yīng)用課件

免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用

——ELISA.1免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用

——ELISA.1酶聯(lián)免疫法

ELISA

50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技術(shù)之后，70年代初又建立了用酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)。它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種免疫測(cè)定技術(shù)。.2酶聯(lián)免疫法

ELISA50年代的免疫熒光（IFA）和免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabellingtechnique）:

是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。特點(diǎn)：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位分類(lèi)：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測(cè)定.3免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabellingt免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)(enzymeimmunoassay)：是將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。

就是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。常用的酶：辣根過(guò)氧化物酶(HRP)

堿性磷酸酶（AP）。.4免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)(enzymeimmunoassay)基本原理①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來(lái)進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

.5基本原理①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活酶聯(lián)免疫法

ELISA.6酶聯(lián)免疫法

ELISA.6.7.7實(shí)驗(yàn)材料ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的材料：1.固相的抗原或抗體2.酶標(biāo)記的抗原或抗體3.酶作用的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。4.相應(yīng)的檢測(cè)儀器..8實(shí)驗(yàn)材料ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)檢測(cè)方法1。夾心法雙抗體夾心法測(cè)抗原（常用）雙抗原夾心法測(cè)抗體2。間接法測(cè)抗體（常用）3。競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體4。捕獲包被法測(cè)抗體5。親和素-生物素ELISA法.9檢測(cè)方法1。夾心法.9雙抗體夾心測(cè)抗原.10雙抗體夾心測(cè)抗原.10雙抗體夾心測(cè)抗原待測(cè)抗原須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，其一端與包被于固相載體上的抗體結(jié)合，另一端與酶標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合。此法適用于檢驗(yàn)各種二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子單價(jià)抗原的測(cè)定。.11雙抗體夾心測(cè)抗原待測(cè)抗原須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，其一端雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類(lèi)似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定。乙肝標(biāo)志物中HBsAb的檢測(cè)常采用本法。關(guān)鍵在于根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同制備酶標(biāo)抗原。.12雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類(lèi)似。.12間接法測(cè)定抗體.13間接法測(cè)定抗體.13間接法的特點(diǎn)本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗體檢測(cè)相應(yīng)抗體。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)。若抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白，也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?14間接法的特點(diǎn)本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原.15競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原.15競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)，孵育洗滌。（3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。.16競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原◆如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合?！羧缡軝z標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少?！魠⒖脊苤兄患用笜?biāo)抗原，孵育后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合最充分。.17競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原◆如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。.18競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的捕獲包被法測(cè)抗體樣品中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法。先將所有樣品IgM（包括特異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。.19捕獲包被法測(cè)抗體樣品中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性I操作步驟如下（1）將抗IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗IgM，洗滌。（2）加入稀釋的待測(cè)標(biāo)本：孵育后樣品中的IgM抗體被固相抗體捕獲，洗滌。（3）加入特異性抗原試劑：其僅與固相上的特異性IgM結(jié)合，洗滌。（4）加入針對(duì)抗原的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合，洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示標(biāo)本中存在特異性IgM抗體，是為陽(yáng)性反應(yīng)。.20操作步驟如下（1）將抗IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗親和素-生物素-ELISA法親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。生物素（biotin）又稱(chēng)維生素H，存在于蛋黃中。可與蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和酶等多種類(lèi)型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，形成一種極為穩(wěn)定的復(fù)合體。把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來(lái)，就可大大提高ELISA的敏感度。.21親和素-生物素-ELISA法親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提3.與固相抗原的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合

取稀釋板中預(yù)孵育的抗原抗體混合液100μl，加入酶標(biāo)板的抗原孔中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中60min。洗板3次。100ul稀釋板酶標(biāo)板37℃，60min洗板3次適用于優(yōu)點(diǎn)注意雙抗體夾心法測(cè)抗原是檢測(cè)抗原最常用的方法，適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原特異性高不能檢測(cè)小分子抗原及半抗原雙抗原夾心法測(cè)抗體乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。間接法測(cè)抗體是檢測(cè)抗體最常用的方法,本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體

1.關(guān)鍵抗原的純度2.另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體

競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原如激素和藥物等ELISA測(cè)定多用此法?？欤挥幸淮伪叵礈爝^(guò)程需要較多的酶標(biāo)記抗原.223.與固相抗原的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合100ul稀釋板酶標(biāo)板37℃，60實(shí)驗(yàn)材料：羊抗人血清白蛋白抗體（一抗）已知含量的人血清白蛋白（作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）待檢人血清白蛋白辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體（二抗）包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液洗板液或稀釋液：PH7.4，0.01mol/LPBS底物溶液：OPD-H2O2終止液：2mol/LH2S04酶標(biāo)反應(yīng)板（一條/人）方法適用于競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢驗(yàn)特異性抗體捕獲包被法測(cè)抗體主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測(cè)定ABS-ELISA

法ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多。

.23實(shí)驗(yàn)材料：方法適用于競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除.24.24實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：制備純化抗原或抗體制備抗原或抗體包備液包被微孔板制備酶標(biāo)記抗體或抗原制備酶催化底物終止液.25實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：制備純化抗原或抗體.25實(shí)驗(yàn)步驟：1.加樣：加待檢樣品0.05ml于已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育30分鐘。(設(shè)置空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔各加0.05ml對(duì)照標(biāo)準(zhǔn))。2.洗滌,新鮮配置洗滌液注滿(mǎn)微孔,停滯15秒棄去.重復(fù)5次.3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.05ml。37℃孵育30分鐘.4.洗滌,新鮮配置洗滌液注滿(mǎn)微孔,停滯15秒棄去.重復(fù)5次.

5.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入底物A液和底物B液各0.05ml，置37℃孵育15分鐘。6.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。7.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。.26實(shí)驗(yàn)步驟：1.加樣：加待檢樣品0.05ml于已包被之反應(yīng)孔中實(shí)驗(yàn)操作：.27實(shí)驗(yàn)操作：.27固定OD值.28固定OD值.28.29.29三、操作步驟包被抗原

抗原用包被液（CBS）稀釋至合適濃度，加入到酶標(biāo)板中，100μl/孔，放入濕盒中，4℃過(guò)夜。次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后傾去），以洗去未包被的游離抗原?？乖?00ul/孔濕盒中，4℃過(guò)夜酶標(biāo)板.30三、操作步驟包被抗原次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔抗原與抗體的預(yù)孵育制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：