凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座

凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)

凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第1頁【目標】掌握凝膠層析基本原理學(xué)習(xí)利用凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)試驗技能凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第2頁

【原理】

凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用含有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠分子篩作用，依據(jù)被分離物質(zhì)分子大小不一樣來進行分離技術(shù)。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第3頁

凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進行分離技術(shù)，又稱之凝膠過濾、分子篩層析或排阻層析。單個凝膠珠本身象“篩子”。不一樣類型凝膠篩孔大小不一樣。凝膠過濾層析凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第4頁帶網(wǎng)孔葡聚糖珠小分子進入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進入珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出凝膠過濾層析過程示意圖凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第5頁凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第6頁總結(jié)：相對分子質(zhì)量較大物質(zhì)因為直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外空間向下流動，所以流程較短，移動速度快；所以首先流出。相對分子質(zhì)量較小物質(zhì)因為直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可完全滲透進入凝膠顆粒網(wǎng)孔，在向下移動過程中，所以流程較長，移動速率慢；所以最終流出。中等大小分子，它們在凝膠顆粒內(nèi)外部分滲透，滲透程度取決于它們分子大小，所以它們流出時間介于二者之間，這么分子大組分先流出，分子小組分后流出。這么樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小次序依次流出，從而到達了分離目標。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第7頁【試驗器材】層析柱恒流泵紫外檢測儀部分搜集器試管等普通玻璃器皿凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第8頁凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第9頁凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第10頁凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第11頁凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第12頁【試驗試劑】待分離樣品葡聚糖凝膠SephadexG-100洗脫液：0.1mol/LpH6.8磷酸緩沖液凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第13頁【操作方法】一、凝膠處理

SephadexG-100干粉經(jīng)蒸餾水室溫充分溶脹48h，或沸水浴中煮沸2h，冷卻至室溫后抽真空脫去顆?？障吨锌諝?。

凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第14頁二、裝柱

關(guān)閉出口，向柱內(nèi)加入洗脫液約1cm高，將濃漿狀凝膠遲緩地傾入柱中，使之自然沉降，凝膠沉降約1㎝高度后打開出水口，繼續(xù)加入凝膠漿，直到凝膠沉積至一定高度即可。裝柱要求連續(xù)，均與，無氣泡，無“紋路”。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第15頁三、平衡將洗脫液與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱入口相連，用2～3倍柱床體積洗脫液平衡，流速為0.5ml/min。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第16頁四、加樣與洗脫將柱中多出液體放掉出，使液面剛好蓋過凝膠，關(guān)閉出口，將1ml樣品沿層析柱管壁小心加入，加完后打開底端出口，使液面降至與凝膠面相平時關(guān)閉出口，加洗脫液至液層4cm左右，接上恒流泵，開始洗脫（0.5ml/min）。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第17頁五、搜集與測定用部分搜集器搜集洗脫液。紫外檢測儀280nm處檢測，將檢測信號輸入色譜工作站系統(tǒng)，繪制洗脫曲線。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第18頁六、凝膠柱處理凝膠用過后，重復(fù)用蒸餾水經(jīng)過柱（2~3倍床體積）即可。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第19頁注意事項各接頭不能漏氣，連續(xù)用小乳膠管不要有破損，不然造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內(nèi)排氣管應(yīng)無液體，并伴隨柱下口溶液流出不停有氣泡產(chǎn)生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內(nèi)液面不停下降，則表示整個系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細檢驗并加以糾正。一直保持柱內(nèi)