克氏原螯蝦源豚鼠氣單胞菌的分離鑒定及其16srdna序列分析

克氏原螯蝦源豚鼠氣單胞菌的分離鑒定及其16srdna序列分析

元寶蝦具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，是中國重要的水產(chǎn)資源。它在全國各地，尤其是長江以南的長江以南。據(jù)統(tǒng)計,全國對克氏原螯蝦的年消費量高達(dá)幾萬噸,具有十分廣闊的養(yǎng)殖前景。自20世紀(jì)90年代克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖在江蘇等地首次獲得成功后,安徽、江蘇、湖北、江西、河南、浙江、湖南、天津、山東、四川、廣東、福建、貴州、重慶、廣西、陜西等省市均不同程度地開展了克氏原螯蝦的養(yǎng)殖1材料和方法1.1感染蝦的來源患病克氏原螯蝦,體長約為(5—7)cm,取自上海天億克氏原螯蝦養(yǎng)殖基地。1.2致病菌的分離用75%酒精對具有典型發(fā)病癥狀的瀕死克氏原螯蝦進(jìn)行體表消毒,然后在無菌條件下取其肝胰腺、肌肉等組織以及頭胸部的積液,分別在TCBS和普通營養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行致病菌株的分離,并將平板在30℃恒溫培養(yǎng)18—24h后進(jìn)行菌株的純化,在斜面瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3培養(yǎng)基上各菌株菌懸液的制備選取健康的克氏原螯蝦進(jìn)行人工回歸感染實驗。先將培養(yǎng)基瓊脂斜面上的各菌株的菌苔分別用無菌生理鹽水洗下,經(jīng)稀釋涂布平板法測定濃度后再用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)各菌懸液濃度為1.0×101.4pcr擴(kuò)增條件及測序生理生化鑒定參照王會聰?shù)确肿予b定以致病菌株的基因組DNA為模板,選用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對其16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增條件為:94℃3min;94℃1min,60℃1min,72℃1min,共35個循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物的純化與測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站中的BLASTn軟件,將致病菌株的16SrDNA序列與GenBank基因庫中已知細(xì)菌的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較后,進(jìn)一步通過軟件Mega4.0對同源性較高的16SrDNA序列進(jìn)行多重比較,并利用鄰接法構(gòu)建致病菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。1.5致病菌生長曲線測定致病菌株液體菌種的制備將致病菌株接種到斜面培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)18h后接種到pH7的100mL無菌營養(yǎng)肉湯中,于30℃、200r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)18h后即為液體菌種。生長因子對致病菌生長的影響取液體菌種1mL接種到100mL無菌營養(yǎng)肉湯中,分別于不同pH(3、5、7、9、11)、溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)、轉(zhuǎn)速(100、150、200、250、300r/min)條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)18h后取樣,測定各條件下致病菌株的A雙氟沙星對致病菌生長的影響取液體菌種1mL分別接種到含雙氟沙星0、6.5、12.5、25、50、100μg/mL的100mLpH5的無菌營養(yǎng)肉湯中,于30℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)18h后取樣,測定各雙氟沙星濃度下致病菌株的A致病菌生長曲線的測定將液體菌種1mL接種到100mLpH5的無菌營養(yǎng)肉湯中,于30℃、200r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng),分別在0、0.5h、1.5h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h分別取樣測定致病菌株的A2結(jié)果2.1疾病的分離從自然發(fā)病克氏原螯蝦的肝胰腺、肌肉、積液中分別分離純化到2株、3株、1株優(yōu)勢細(xì)菌,分別暫名為L2.2消毒疾病的評估菌株L2.3致病菌生長特性pH對致病菌生長的影響實驗結(jié)果表明(圖2),豚鼠氣單胞菌L溫度對致病菌生長的影響實驗結(jié)果表明(圖3),豚鼠氣單胞菌L轉(zhuǎn)速對致病菌生長的影響實驗結(jié)果表明(圖4),豚鼠氣單胞菌L雙氟沙星對致病菌生長的影響實驗結(jié)果表明(圖5),豚鼠氣單胞菌L致病菌的生長曲線實驗結(jié)果表明(圖6),0—1.5h為生長延遲期,1.5—24h為對數(shù)生長期,24—36h為穩(wěn)定期,36h以后為衰亡期。3發(fā)酵菌株的生長特性豚鼠氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物常見致病菌,可危害中華鱉(Triongxsinensis)、豐產(chǎn)鯽[CarassiusauratusofPenze(♀)×Cyprinusacutidorsalis(♂)]、鯉(CyprinuscarpioL.)、日本鰻鱺(Anguillajaponica)、南方鲇(SilurusmeriordinalisChen)、胡子鯰(Clariasfuscus)、雜交鱘([Husohuso(♀)×Acipenserruthenus(♂)]、中國對蝦(Penaeuschinensis)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物豚鼠氣單胞菌的生化特性具有菌株差異性。本實驗分離的豚鼠