克氏原螯蝦大砭器對卵巢發(fā)育的影響

克氏原螯蝦大砭器對卵巢發(fā)育的影響

laufer等人（1987）首次證明了甲殼動(dòng)物的頭部特征（mf），這是由昆蟲保護(hù)性激素（mf）的非環(huán)氧化形式組成的。MF在十足目甲殼動(dòng)物的卵黃發(fā)生過程中積極合成并大量出現(xiàn)在血淋巴中,而且發(fā)現(xiàn)MF在兩性中均存在,因此認(rèn)為MF具有促性腺激素的作用[1材料和方法1.1暗紅的隔年蝦和活體解剖蝦克氏原螯蝦于1996和1997年4～10月購自本市圖們路及定海路菜場。一類為體色暗紅的隔年蝦,另一類為當(dāng)年的幼蝦,體呈綠色。實(shí)驗(yàn)蝦逐尾稱體重和測量體長(眼柄基部至尾柄末端),活體解剖取出不同發(fā)育階段的卵巢計(jì)算成熟系數(shù),并確定卵巢的分期[李勝和趙維信1999]。按趙維信和李勝[1998]方法解剖取出大顎器。1.2小箱飼養(yǎng),定期投喂選用隔年雌螯蝦20尾,體長7.0～8.3cm,體重22～41克,分成2組,處理組和對照組各20尾,分別飼養(yǎng)在兩個(gè)小水族箱內(nèi),每日投喂顆粒飼料、換水,飼養(yǎng)35天(4月18日～5月23日)。每隔5天在處理組雌螯蝦腹部肌肉內(nèi)植入一對大顎器。用于埋植的大顎器取自卵巢處于恢復(fù)期或卵黃發(fā)生前期的個(gè)體,每尾蝦共埋植7次,對照組不作任何處理。1.3遠(yuǎn)離集體培養(yǎng)取出螯蝦的卵巢,放入每100mL螯蝦生理溶液[1.4丙酮-丙酮法按Tsukimura和Kamemoto[1991]方法略加修改。取5對或25對雌螯蝦的大顎器進(jìn)行粗提取,25對大顎器加入5mL丙酮進(jìn)行勻漿,傾入10mL離心管中,再用少量丙酮多次沖洗勻漿器并傾入離心管中,2500r/min離心15分鐘,取出上清液,然后用空氣壓縮機(jī)吹干丙酮提取液至黃色粘稠物質(zhì),再加入10mL螯蝦生理溶液充分溶解。5對大顎器用同樣方法提取后,最后用2mL螯蝦生理溶液溶解。1.5加修改修改卵巢總RNA的提取方法,按戴維斯[1990]方法略加修改。卵巢小塊經(jīng)離體培育后,分別準(zhǔn)確稱重進(jìn)行RNA提取,采用紫外分光光度計(jì)751型,在波長260nm處讀光密度值(OD值),即RNA濃度。1.6工作液的配制17α-羥孕酮(17α-P)10mg,溶解在10mL無水乙醇中,再用螯蝦生理溶液經(jīng)倍比稀釋成濃度為15pmol/mL的工作液。保幼激素類似物-ZR515(JHA-ZR515)40mg/2mL用螯蝦生理溶液先稀釋成1.5mg/mL,再經(jīng)倍比稀釋成濃度為1.5μg/mL的工作液。1.7處理數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用t-檢驗(yàn)、方差分析和均數(shù)間多重比較,以及協(xié)方差和線性回歸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1兩組蝦的成熟系數(shù)和卵徑大顎器埋植實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖全部實(shí)驗(yàn)蝦,取出卵巢稱重,然后做組織切片觀察,結(jié)果見表1。處理組蝦死亡2尾,對照組死亡4尾。處理組蝦的成熟系數(shù)(GSI)和卵徑都顯著高于對照組(P<0.05);處理組蝦的卵巢發(fā)育優(yōu)于對照組,大部分個(gè)體的卵巢已進(jìn)入卵黃發(fā)生期,而對照組的卵巢尚未發(fā)育至卵黃發(fā)生期。2.2激素對離體發(fā)育期離體的作用實(shí)驗(yàn)采用卵黃發(fā)生前期卵巢(GSI為0.12%)、初級(jí)卵黃發(fā)生期卵巢(GSI為0.28%)和次級(jí)卵黃發(fā)生期卵巢(GSI為1.85%)各1組。每組卵巢再分成5個(gè)卵巢小塊,每個(gè)卵巢小塊為一份離體培育,加入1mL199培養(yǎng)基,2mLMOE或2mL17α-P,或2mLJHA-ZR515或17α-P+JHA-ZR515各1mL;對照組未加任何激素或MOE,僅為3mL培養(yǎng)基,組成5個(gè)培養(yǎng)系列。試驗(yàn)結(jié)果見表2。對于卵黃發(fā)生前期的卵巢,MOE和兩種激素分別作用或聯(lián)合作用對卵徑增大均無作用(P>0.05)。對于初級(jí)卵黃發(fā)生期卵巢,除17α-P的作用不顯著(P>0.05)外,其它3組與對照組比較均有極顯著作用(P<0.01)。對于次級(jí)卵黃發(fā)生期卵巢,17α-P有顯著性作用(P<0.05),其余3組均為極顯著作用(P<0.01)。2.3不同發(fā)育時(shí)期的moe對卵黃總rna含量的影響分別用卵巢處于發(fā)育早期、卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期、恢復(fù)期的雌性螯蝦的MO各5對進(jìn)行提取。離體培育的卵巢小塊均處于初級(jí)卵黃發(fā)生期,使用4尾螯蝦的卵巢,成熟系數(shù)分別為0.25%、0.35%、0.34%、0.29%。同時(shí)用17α-P和JHA-ZR515作為參照,卵巢小塊總RNA含量變化見圖1。與對照組比較,卵巢處于發(fā)育早期的MOE對卵巢小塊總RNA含量沒有顯著性作用(P>0.05),其余5組均有極顯著促進(jìn)作用(P<0.01),其中以處于卵黃發(fā)生期的MOE促進(jìn)作用最強(qiáng)。卵巢處于恢復(fù)期的MOE與卵黃發(fā)生前期的MOE之間無顯著性差異;卵黃發(fā)生期的MOE、JHA-ZR515和17α-P與恢復(fù)期的MOE和卵黃發(fā)生前期的MOE之間有顯著性差異(P<0.05);卵黃發(fā)生期的MOE與JHA-ZR515和17α-P之間有極顯著差異(P<0.01),前者誘導(dǎo)卵巢小塊的總RNA含量是后者的2倍。3不同發(fā)育時(shí)期的moe對卵黃發(fā)生期離子型各發(fā)育的影響本工作為國內(nèi)首次進(jìn)行十足目甲殼動(dòng)物MO功能的研究,采用傳統(tǒng)的內(nèi)分泌腺移植方法,將MO整體埋植在同種另一個(gè)體的腹部,該試驗(yàn)結(jié)果表明MO埋植對促進(jìn)接受體(受埋植個(gè)體)成熟系數(shù)升高和卵徑增大有顯著作用,加速了接受體的卵巢發(fā)育。在活體研究基礎(chǔ)上,又采用離體研究方法,進(jìn)一步證明大顎器提取物(MOE)對性腺有直接作用,MOE對離體卵徑增大和卵巢總RNA含量升高有明顯作用。卵黃發(fā)生期卵巢(包括初級(jí)和次級(jí)卵黃發(fā)生期)對MOE十分敏感,而卵黃發(fā)生前期卵巢的反應(yīng)不明顯(表2),表明不同發(fā)育時(shí)期的卵巢對MOE的反應(yīng)有差異。另外,卵黃發(fā)生期的MOE較其它各卵巢發(fā)育時(shí)期的MOE對卵巢總RNA含量升高更顯著(圖1),這表明卵黃發(fā)生期MOE的生物活性最高,這與克氏原螯蝦的MO在卵黃發(fā)生期顏色較深,體積較大,MO細(xì)胞直徑增大,細(xì)胞輪廓明顯(超微結(jié)構(gòu)觀察為MO細(xì)胞外緣的基膜增厚)和胞質(zhì)中光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體極為豐富等一系列形態(tài)學(xué)變化相一致[李勝和趙維信1999、本工作中,17α-P對卵黃發(fā)生前期和初級(jí)卵黃發(fā)生期卵徑增大無作用(表2),這與Tsukimura和Kamemoto[1991]及趙維信等[1996]的結(jié)果不符,這可能是本實(shí)驗(yàn)使用的17α-P劑量濃度偏低的緣故;另外,使用相同濃度的17α-P,對次級(jí)卵黃發(fā)生期卵徑增大確有作用,這也反映出不同