雞馬立克氏病病毒基因操作技術(shù)研究進(jìn)展

雞馬立克氏病病毒基因操作技術(shù)研究進(jìn)展

雞馬立克?。╩d）是由雞馬立克病病毒（mdv）引起的一種高度接觸傳染的淋巴組織腫瘤。該病以鳥類t淋巴細(xì)胞增多、高度接觸傳染和雞的嚴(yán)重免疫抑制為特征。1907年,JosefMarek首次報(bào)道,稱之為“神經(jīng)炎”,1967年病毒被分離鑒定,1969年第一支通過傳代致弱的活疫苗(MDVHPRS-16)被使用,1970年該疫苗被自然分離的野毒株HVT疫苗取代對(duì)于DNA病毒基因結(jié)構(gòu)功能的研究,一般可直接在DNA水平上對(duì)病毒基因組進(jìn)行操作,但MDV基因組龐大、嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合性特點(diǎn),用于DNA病毒的常規(guī)基因操作技術(shù)對(duì)其研究十分困難,構(gòu)建感染性克隆就非常必要。本文對(duì)MDV基因操作技術(shù),特別是細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)技術(shù)的構(gòu)建過程及研究進(jìn)展作一綜述。1mdv基因操作技術(shù)在利用BAC系統(tǒng)或黏粒構(gòu)建MDV的感染性克隆之前,人們對(duì)MDV基因功能的研究通常是應(yīng)用常規(guī)的分子克隆技術(shù)對(duì)靶基因?qū)嵤┎僮?然后通過同源重組構(gòu)建重組病毒。重組病毒構(gòu)建的基本過程為:首先兩端帶有同源臂的靶基因被克隆入大腸桿菌中,依靠常規(guī)分子克隆技術(shù),靶基因被修飾(刪除、插入外源基因表達(dá)盒或進(jìn)行點(diǎn)突變,同時(shí)輔之于插入選擇性標(biāo)記基因),含有修飾后靶基因的載體片段與病毒基因組共同轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞,進(jìn)行同源重組,經(jīng)幾輪篩選,獲得重組病毒,通過分析突變帶來的影響來分析基因結(jié)構(gòu)與功能。其缺點(diǎn)是,標(biāo)記基因的導(dǎo)入以及MDV與宿主細(xì)胞高度結(jié)合的特性,使得重組病毒的篩選工作變得費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且在篩選過程中容易引入一些假突變,致使所篩選的重組病毒發(fā)生弱化;甚至可能會(huì)因?yàn)橥庠椿虻膶?dǎo)入而影響病毒的表型。利用該技術(shù)人們構(gòu)建了許多重組MDV(主要是MDV-1),但大部分突變區(qū)集中在病毒復(fù)制非必需區(qū)或是與致弱無關(guān)的區(qū)域,而且多數(shù)集中在短獨(dú)特區(qū)(US)區(qū)。由于不能進(jìn)行回復(fù)突變來重新構(gòu)建親代病毒,因此對(duì)MDV基因組的插入或刪除操作對(duì)其生物學(xué)特性的影響缺乏有說服力的佐證另一個(gè)對(duì)MDV基因的操作技術(shù)則是利用禽反轉(zhuǎn)錄病毒,通過共轉(zhuǎn)染隨機(jī)整合入MDV-1中,但主要在病毒的復(fù)制非必需區(qū)。一株反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR插入到MDV-1的IRS區(qū)中導(dǎo)致MDV-1的致弱便是其中的一例。還有一個(gè)研究MDV基因功能的手段是反義RNA,在病毒基因體外表達(dá)過程中,通過寡核苷與mRNA結(jié)合而阻斷基因的表達(dá)。但是這些方法對(duì)病毒的體外研究是非常有局限性的2002年,Reddy等2基于bac系統(tǒng)的載體修飾技術(shù)BAC技術(shù)是20世紀(jì)90年代新發(fā)展起來的一種基于F因子的DNA克隆載體系統(tǒng)。與其它的高容量載體系統(tǒng)(質(zhì)粒、黏粒)相比,BAC載體不僅具有可攜帶大片段、在宿主體內(nèi)保持低拷貝數(shù)的優(yōu)點(diǎn),而且基于BAC系統(tǒng)成熟的基因修飾技術(shù)使人們對(duì)克隆在BAC載體上的外源片段的修飾變得簡(jiǎn)單高效。這些技術(shù)包括Red/ET-cloning系統(tǒng)和Cre/loxP(FLP/FRT)系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組、轉(zhuǎn)座子技術(shù)等自1997年鼠巨細(xì)胞病毒BAC被成功構(gòu)建以來,人們開始把BAC用于皰疹病毒感染性克隆的構(gòu)建,很多皰疹病毒BAC相繼被克隆成功3mdv重組病毒的構(gòu)建皰疹病毒具有滾環(huán)復(fù)制的特點(diǎn),正是基于其存在基因組自我環(huán)化的階段,在MDV形成環(huán)化基因組時(shí)把BAC載體插入MDV的非必需區(qū),實(shí)現(xiàn)MDVBAC的環(huán)化。MDVBAC構(gòu)建的基本步驟為:構(gòu)建含有同源臂的BAC轉(zhuǎn)移載體,然后把BAC載體和病毒基因組共轉(zhuǎn)染入易感細(xì)胞,經(jīng)過經(jīng)典的同源重組后加壓篩選獲得重組病毒,適時(shí)提取病毒感染細(xì)胞的總基因組,電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B,經(jīng)過抗性基因篩選陽(yáng)性克隆,得到皰疹病毒BAC,重新轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞即可獲得感染性克隆。在大腸桿菌中,利用宿主DNA的合成機(jī)制,BACDNA作為質(zhì)粒復(fù)制,并保持低拷貝數(shù)。在真核細(xì)胞中,皰疹病毒利用自己的核酸和酶系統(tǒng)滾環(huán)復(fù)制(在核衣殼中呈線性),在其生產(chǎn)感染期進(jìn)行基因表達(dá);而在BACDNA中,病毒基因是不表達(dá)的,這樣病毒很容易被分離,也很容易對(duì)其進(jìn)行基因修飾,經(jīng)修飾后的BACDNA再次轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,即可得到各種突變后的重組病毒。其中關(guān)鍵有以下4點(diǎn):3.1非必需區(qū)的篩選BAC載體表達(dá)盒只能插入到病毒基因組中病毒復(fù)制非必需的區(qū)域,因此非必需區(qū)的篩選是病毒活載體構(gòu)建的先決條件。現(xiàn)已證實(shí)MDV的US1、US10、US2、US3、US6、胸苷激酶(TK)基因等是病毒復(fù)制的非必需區(qū)。目前常用的插入位點(diǎn)為US2或US10區(qū)。3.2mdv重組病毒的鑒定篩選方法是獲得重組病毒的關(guān)鍵技術(shù)之一。目前最常用的重組病毒篩選方法有3種,即以病毒本身的TK基因作為選擇標(biāo)記、以細(xì)菌β-半乳糖苷酶基因或綠色熒光蛋白基因等作為選擇標(biāo)記和插入報(bào)告基因用藥物篩選。由于同源重組發(fā)生的機(jī)率相當(dāng)?shù)?加之MDV病毒嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合性特點(diǎn),在重組毒的純化過程中野毒的生長(zhǎng)永遠(yuǎn)占優(yōu)勢(shì),通過無限稀釋法篩選和純化重組毒相當(dāng)困難。因此利用前2種方法篩選重組MDV-1幾乎不可能篩到重組毒。過去成功構(gòu)建的MDVBAC中,都是以Eco-gpt作為重組病毒篩選標(biāo)記基因。其基本原理為:BAC轉(zhuǎn)移載體與病毒DNA轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)經(jīng)2～3次傳代后,細(xì)胞培養(yǎng)液更換為加壓培養(yǎng)液(普通細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的霉酚酸)。經(jīng)3～5輪加壓篩選,由于霉酚酸阻斷了病毒的嘌呤代謝途徑,只有經(jīng)DNA重組將8.8kb的目的片段正確插入到病毒的非必需基因US2區(qū)的重組病毒才能表達(dá)黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶,該酶利用外源黃嘌呤完成了鳥嘌呤的外源補(bǔ)救合成,補(bǔ)救了重組病毒DNA的復(fù)制,只有重組病毒才能持續(xù)生存下來,從而有利于重組病毒的篩選、富集和純化。3.3總dna的提取時(shí)機(jī)獲取MDV環(huán)化基因組是成功獲得BACDNA的關(guān)鍵,因此提取感染病毒總DNA的時(shí)機(jī)最為重要。一般采取在病毒復(fù)制高峰期前后不同時(shí)間間隔提取MDV基因組,以最大可能獲得環(huán)化基因組。3.4bac重組病毒的致病性經(jīng)電轉(zhuǎn)獲得的MDVBAC陽(yáng)性克隆,在轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞時(shí)很多都不具有感染性。首先需要鑒定這些陽(yáng)性克隆中MDV生長(zhǎng)必需基因的完整性,在保證必需基因無突變或缺失的情況下再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其次,由于轉(zhuǎn)染用的MDVBACDNA理論上講都是單克隆的,并不是含有完整基因組的MDVBACDNA都有感染性,感染性只存在于MDV生命循環(huán)中某一階段,基因組可能有特定的三、四級(jí)結(jié)構(gòu),因此只能通過大量轉(zhuǎn)染來“海選”,找出具有感染性的克隆。這也是病毒反向遺傳操作的難點(diǎn)和重點(diǎn)所在。以上是利用經(jīng)典的同源重組技術(shù)在真核細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)BAC載體向MDV基因組中的插入。也有人利用轉(zhuǎn)座子通過病毒DNA與BAC載體體外轉(zhuǎn)痤后轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞構(gòu)建了MDVBAC,展示了一個(gè)鑒定MDV非必需基因更加快高效的工具。Mahony等在構(gòu)建BHV21BAC過程中,利用TK基因內(nèi)的Nsi酶切位點(diǎn)(該酶切位點(diǎn)是基因組中惟一的),在體外將病毒基因組酶切為2段和去磷酸化后,再將BAC質(zhì)粒以同一種酶切線性化后進(jìn)行連接和環(huán)化,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B獲得BHV21BAC,提取的BAC在轉(zhuǎn)染牛細(xì)胞系CRIB21后獲得了具有感染性的病毒突變株。實(shí)現(xiàn)了攜帶皰疹病毒全長(zhǎng)基因組的BAC質(zhì)粒的體外構(gòu)建,簡(jiǎn)化了皰疹病毒感染性BAC系統(tǒng)的構(gòu)建方法。4mdv基因結(jié)構(gòu)功能第一個(gè)構(gòu)建成功的MDV-BAC(20)是源于MDV-1的584Ap80C株,用QM7細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng),并刪除了gB基因創(chuàng)造了致死性突變,隨后人們對(duì)MDV基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的研究取得了重大進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)gE、gI、UL46、UL47、UL48是MDV復(fù)制非必需的,UL49.5、gM是必需的;缺失RLORF4、VIL-8會(huì)導(dǎo)致MDV-1致弱,而RLORF5缺失則不會(huì)影響MDV-1毒力,132bp隨著傳代次數(shù)的增加拷貝數(shù)增加,但不是MDV-1毒力減弱的主要原因。在水平傳播方面,UL13是病毒生長(zhǎng)非必需的,但與其水平傳播有關(guān);US2、UL13、UL44是水平傳播必需的,缺少其中任何一個(gè)基因病毒的水平傳播能力都受到抑制在研究MDV基因結(jié)構(gòu)功能的同時(shí),人們對(duì)來自疫苗株的BAC重組毒、拯救毒、BACDNA與親本毒一起做了免疫保護(hù)試驗(yàn),結(jié)果表明,BAC重組毒、BAC拯救毒、親本毒的免疫保護(hù)率無明顯差異,相對(duì)的BACDNA的免疫保護(hù)率比較低。人們認(rèn)為BACDNA免疫效率的低下可能與DNA疫苗在體內(nèi)的作用機(jī)制以及免疫途徑有關(guān)。Tischer等在利用MDVBAC作為新型病毒載體方面人們也做了大量研究。Petherbridge等5mdv基因在大腸桿菌中的應(yīng)用MDVBAC的成功構(gòu)建是MDV分子遺傳學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展。通過BAC基因操作技術(shù)可以非常靈活地對(duì)MDV的任一基因進(jìn)行突變,以揭示該基因在MDV生命循環(huán)中的角色;利用MDVBAC可以作為基因載體表達(dá)外源基因,也可以對(duì)遺傳背景不清楚的毒株直接測(cè)序或進(jìn)行序列比較,還可以通過對(duì)強(qiáng)毒株致弱設(shè)計(jì)新疫苗(包括致弱的活疫苗和DNA疫苗)。但其也存在著局限性。首先,盡管許多關(guān)于MDV親代毒株和插入BAC后的重組毒以及MDVBACDNA拯救毒進(jìn)行的體內(nèi)和體外生長(zhǎng)試驗(yàn)表明它們的生物學(xué)特性無明顯差異,在某種程度上可以利用MDVBACDNA代替親代毒株進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)特性研究,但BAC拯救毒與親代毒體內(nèi)體外的生物學(xué)特性還是存在一定的差異,如水平傳播能力的喪失,體外生長(zhǎng)速度的減慢、攻毒后免疫保護(hù)效力的降低等。因此,利用MDVBAC來研究MDV基因的功能及其它生物學(xué)特性還是有一定的局限性。其次,BAC在大腸桿菌中的穩(wěn)定性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。另外,在后基因組時(shí)代,很多研究已經(jīng)表明MDV的致瘤機(jī)制、傳播機(jī)制等生物學(xué)特性是多個(gè)基因產(chǎn)品及調(diào)控元件、mRNA、蛋白質(zhì)水平以及與宿主的相互作用多層次綜合調(diào)控的結(jié)果,這遠(yuǎn)非在MDVBAC平臺(tái)即可研究清楚的。6mdvbac應(yīng)用科學(xué)家在MDV研究方面取得了許多具有里程碑的認(rèn)識(shí):MDV疫苗是世界上第一個(gè)被廣泛使用的抗腫瘤疫苗;實(shí)踐中首次被用于胚胎期免疫接種以預(yù)防新生動(dòng)物免受野毒攻擊;MDV疫苗的廣泛使用造成了MDV毒力的不斷增強(qiáng)。MD也是人類腫瘤特別是病毒誘導(dǎo)的腫瘤研究方面優(yōu)秀的通用小動(dòng)物疾病模型。但我們對(duì)MD的致瘤機(jī)制、水平傳播機(jī)制及免疫機(jī)制還不十分清楚,有待深入研究,MDV部分基因的結(jié)構(gòu)功能也需要進(jìn)一步研究,利用MDVBAC技術(shù)必將為以上的研究帶來更多新的突破。MDV毒力的不斷增強(qiáng)為控制MD帶來了嚴(yán)竣的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的MD疫苗開發(fā)策略似乎已經(jīng)走入了窘境,MDVBACDNA給我們帶來了新的希望。與其它常見的DNA疫苗不同,MDVBACDNA疫苗含有完整的全長(zhǎng)基因組;其注入機(jī)體后與常規(guī)的活苗(CVI988弱毒苗等)的作用模式幾乎相同。與現(xiàn)在使用的弱毒苗相比,它有很多優(yōu)點(diǎn):第一,BACDNA疫苗保證了進(jìn)入雞體內(nèi)的疫苗毒是單克隆的,避免了在雞體內(nèi)病毒之間重組的發(fā)生而導(dǎo)致的變異;用BACDNA保存種毒,同樣減少了病毒連續(xù)傳代造成毒力變異;第二,使用保存方便。目