川芎嗪對擴張型心肌病大鼠左心收縮功能的影響及機制

川芎嗪對擴張型心肌病大鼠左心收縮功能的影響及機制

擴張性心肌病（cdm）是心力衰竭的主要原因之一。目前，還沒有關(guān)于其發(fā)病機制的研究清楚，也沒有治療臨床上有效藥物的記載。1材料和方法1.1動物房環(huán)境適應(yīng)清潔級健康成年雄性SD大鼠，體重（200±20)g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2018-0002，動物質(zhì)量合格證號為44007200058765。飲用水為滅菌二級超純水，飲用水質(zhì)量符合中華人民共和國《生活飲用水衛(wèi)生標準》GB5749-2006的規(guī)定。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對濕度范圍40%～70%。大鼠在實驗前在動物房環(huán)境中適應(yīng)1周。大鼠白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)ELISA試劑盒購自北京四正柏公司，大鼠氨基末端腦鈉肽前體（NterminalproBtypenatriureticpeptide,NTproBNP)ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，PrimeScriptRTMasterMix、SYBRPremixExTaqⅡ試劑盒均購自Takara公司，鹽酸阿霉素針劑購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司，LTZ、白藜蘆醇（Resveratrol,RES）購自Sigma公司，CEACAM1、p-p38蛋白（phosphorylatedp38mitogenactivatedproteinkinases,p-p38MAPK）、caspase3抗體均購自CST公司，引物由生工公司合成。1.2阿霉素-res組的dcm模型建立將SD大鼠隨機分成對照組（Sham）、DCM組、LTZ組和RES組，每組16只。DCM組通過腹腔內(nèi)注射阿霉素建立大鼠DCM模型（2.5mg/kg,2次/周，共4周）；LTZ組在通過腹腔注射阿霉素（2.5mg/kg,2次/周，4周）建立大鼠DCM模型的同時，經(jīng)過腹腔注射川芎嗪注射液（100mg/kg·d,4周）；RES組在通過腹腔注射阿霉素（2.5mg/kg,2次/周，4周）建立大鼠DCM模型的同時，經(jīng)過腹腔注射白藜蘆醇注射液（20mg/kg·d,4周）；Sham組經(jīng)過腹腔注射同等容積的PBS。1.3左心室射血分數(shù)采用PhilipsiE33型彩色多普勒超聲新生兒心臟探頭，分別在造模前和造模后4周進行檢查。將大鼠以10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉（0.36g/kg），仰臥位并褪凈前胸毛后固定，測量舒張期室間隔厚度（interventricularseptumthicknessdiameter,IVSd）、舒張期左室內(nèi)徑（leftventricularend-diastolicdiameter,LVEDd），舒張期左室后壁厚度（leftventricularposteriorwallthicknessdiameter,LVPWd），采用Simpson法測量左心室射血分數(shù)（leftventricularejectionfraction,LVEF）。1.4組織形態(tài)觀察造模4周后將各大鼠處死，分離心臟組織，4%甲醛溶液固定、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片等處理，脫蠟復水后用蘇木精和伊紅染色，在顯微鏡下觀察組織形態(tài)。1.5elisa測試給藥4周后各組大鼠采集靜脈血，按照ELISA說明書操作，檢測血清NTproBNP、IL-1β、TNF-α、TGF-β1變化。1.6實際的pcr反應(yīng)藥物干預4周后處死大鼠，分離心臟組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系包括SYBR1.7半定量分析方法藥物干預4周后處死大鼠，分離心臟組織，提取總蛋白質(zhì)，每孔加入20μL蛋白質(zhì)溶液，在10%的SDS中80v、30min及120v、1h進行電泳分離，半干轉(zhuǎn)液38mA、90min轉(zhuǎn)入PVDF膜，5%牛奶封閉2h，加入兔抗大鼠CEACAM1一抗（1∶1000）、caspase3一抗（1∶1000）、p-p38MAPK一抗（1∶500）及GAPDH一抗（1∶1000)4℃孵育過夜，1‰TBST洗10min3次，加入羊抗兔二抗（1∶6000）孵育1h,1‰TBST洗10min3次，加入ECL發(fā)光液100μL在ImageQuantRTECL冷CCD成像系統(tǒng)進行顯影，用ImagequantTL軟件進行半定量分析。1.8統(tǒng)計分析采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以2結(jié)果2.1各組大鼠心肌組織病理學檢查比較在給予阿霉素刺激4周后，HE染色結(jié)果表明Sham組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)完整；可見圓形或類圓形的細胞核；細胞間隙無水腫，胞質(zhì)與血管豐富。DCM組大鼠的心臟明顯擴大，心肌細胞水腫，炎性細胞浸潤增多，細胞間隙水腫、增寬，部分顆粒、空泡樣變性，心肌纖維排列不齊，出現(xiàn)心肌重塑現(xiàn)象。LTZ組大鼠在注射川穹嗪后心肌細胞水腫減輕，炎性細胞浸潤減少，心肌纖維排列較齊，心肌重塑現(xiàn)象減弱，心臟擴大情況明顯減輕。而RES組大鼠在注射白藜蘆醇后心臟擴大更加明顯，細胞核固縮、變形，見圖1（封二）。和Sham組相比，DCM組LVEDd、NTproBNP水平明顯增加，LVEF明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與DCM組大鼠相比，LTZ組LVEDd、NTproBNP水平顯著下降，LVEF顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而RES組大鼠LVEDd、NTproBNP顯著上升，LVEF顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。2.2各組大鼠血清il-1和tgf-與Sham組大鼠相比，DCM組大鼠血清促炎因子IL-1β和TNF-α水平明顯增加而抗炎因子TGF-β1水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與DCM組大鼠相比，LTZ組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平明顯下降而TGF-β1水平增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與DCM組大鼠相比，RES組大鼠IL-1β和TNF-α水平明顯增加而TGF-β1水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。2.3蛋白表達水平與Sham組大鼠相比，DCM組大鼠心肌組織中CEACAM1、caspase3和p-p38MAPK的mRNA和蛋白表達水平顯著增加（P<0.05）；與DCM組大鼠相比，LTZ組大鼠心肌組織中CEACAM1、caspase3和p-p38MAPK的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）；與DCM大鼠相比，RES組大鼠CEACAM1、caspase3、p-p38MAPK的mRNA和蛋白表達水平顯著增加（P<0.05），見圖3、4。3胞和細胞川圖和ceacam1對dcm的影響CEACAM1是一種免疫球蛋白超家族跨膜糖蛋白，在人體內(nèi)廣泛分布，大量表達于腫瘤細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、中性粒細胞和淋巴細胞川穹嗪是中國傳統(tǒng)中藥川穹