南瓜木葡聚糖提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

南瓜木葡聚糖提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

cucurbita.spp是該屬木馬科的一種一級植物，具有各種重要的功能成分。經(jīng)熱水提取,離子交換層析獲得的南瓜多糖具有明顯的降血糖活性[2~6],而對多糖提取后的殘渣,目前還缺乏相應(yīng)的研究報道。作為一種雙子葉植物,南瓜果渣中富含木葡聚糖。木葡聚糖是功能性多糖,很容易攜帶藥物穿過腸道壁,提高口服性藥物的吸收率。多種木葡聚糖及其降解產(chǎn)生的部分低聚糖被報道具有抗腫瘤活性。為了能高效的制備南瓜木葡聚糖,本文對南瓜木葡聚糖的提取工藝進行優(yōu)化。采用濃堿提取木葡聚糖,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,運用響應(yīng)曲面法研究了液料比(x1)、堿濃度(x2)和提取時間(x3)對南瓜木葡聚糖得率的影響及交互作用,優(yōu)化了木葡聚糖的提取工藝,并運用R2,p水平和學(xué)生氏-t檢驗進行擬合度和顯著性檢驗,根據(jù)優(yōu)化工藝完成驗證實驗。1材料和方法1.1儀器和檢測方法南瓜渣南瓜經(jīng)水提后的殘渣,本實驗室制備。電子天平,粉碎機,抽濾瓶,5mф27mm透析袋,98-1-B型電子調(diào)溫電熱套,LXJ-IIB低速大容量多管離心機,GL-20G-Ⅱ高速離心機,T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計,868型PH儀,R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,循環(huán)水式真空泵SHZ-(DⅢ),W201B恒溫水浴鍋,LGJ-18型冷凍干燥機。1.2實驗方法1.2.1提取過程南瓜木葡聚糖的提取工藝見圖1。提取條件隨實驗設(shè)計進行變化,所有的實驗重復(fù)兩次,取平均值。1.2.2水質(zhì)中in和3.3gi2的吸光度測定在1mL樣液中加入750μL的Gramstain(每升水含6.6gKI和3.8gI2)及5mLNa2SO4(0.2g/mL),混合液在室溫下放置1h,在620nm下測定吸光度。1.2.3單因素實驗1.2.3.提取率的測定取2g南瓜渣,分別按10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1的比例加入4mol/LNaOH,提取12h,計算得率。1.2.3.2.提取時間對28.木冬糖含量的影響取2g南瓜渣,按30∶1的比例加入4mol/LNaOH,分別提取3、6、9、12、15、18、21h,計算得率。1.2.4多因素實驗1.2.4.變量編碼:實驗a型,c通過單因素實驗,選定3因素5水平進行中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計。自變量x1(液料比,R),x2(NaOH濃度,C),x3(提取時間,t)的5個水平的編碼見表1,實驗設(shè)計見表2(見結(jié)論部分)。為了充分估計實驗誤差,實驗進行隨機排序,并在實驗的中心點進行6次重復(fù)。變量編碼根據(jù)下述方程(1)進行。其中:Xi為自變量的代碼值;為自變量的真實值;!Xi為自變量在中心點的真實值;為變化幅度。1.2.4.顯著性分析結(jié)果實驗重復(fù)二次,結(jié)果取平均值,將其標(biāo)記為響應(yīng)值Yi。對應(yīng)Yi建立如下擬合方程:其中:Yi為響應(yīng)值,β0為常數(shù);β1、β2、β3為線性影響系數(shù);β11、β22、β33為平方效果影響系數(shù);β12、β13、β23為交互作用系數(shù)。方程的準(zhǔn)確性通過多元回歸系數(shù)R2檢驗。各系數(shù)的顯著性進行t檢驗和p檢驗。統(tǒng)計軟件采用美國Statsoft公司STATISTICA軟件,版本號為6.0。2結(jié)果分析2.1單因素試驗的結(jié)果2.1.1液料比對提取得率的影響不同液料比對南瓜木葡聚糖得率的影響見圖2,由圖2可以看出,隨著液料比的增加,提取得率會發(fā)生變化,在20倍后得率逐漸減小,20倍處的得率最高。所以,在多因素實驗中,我們選12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1為優(yōu)化水平。2.1.2不同液料比對木葡聚糖降解反應(yīng)的影響不同提取時間對南瓜木葡聚糖得率的影響見圖3。由圖3可以看出,隨著液料比的增加,提取得率會發(fā)生變化,在12h后出現(xiàn)降低,可能是由于在長時間濃堿作用下,木葡聚糖發(fā)生了降解反應(yīng)。所以,在多因素實驗中,我們選6、9、12、15、18h為優(yōu)化水平。2.2通過提取杏仁、木冬糖和優(yōu)化曲線2.2.1回歸結(jié)果分析為了研究南瓜木葡聚糖提取中各因素的顯著性,優(yōu)化南瓜木葡聚糖的提取工藝,我們在實驗中采用中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計,實驗進行二次重復(fù),其結(jié)果和響應(yīng)值見表2。運用STATISTICA軟件對表2數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,產(chǎn)生如下回歸方程:利用學(xué)生氏-t檢驗和p水平值檢驗回歸方程各項的顯著性見表3。因為t的絕對值越大,p水平越小,那么對應(yīng)的項就越顯著,故從表3中我們可以看出,影響最顯著的是液料比的平方項(x1x1),隨后是NaOH濃度的平方項(x2x2)和NaOH濃度(x2)。x1x1對應(yīng)的t值為-16.2435,p水平為0.00000002,而x2x2和x2的t值分別為-13.8831和-12.1694,p水平分別為0.00000007和0.00000026。方程擬合系數(shù)R2=98.19%,這說明模式方程滿足98.19%的樣品空間,實驗?zāi)Ｊ嚼硐搿?.2.2響應(yīng)面的確定為了研究提取時間和料液比間的交互作用,常采用圖解法進行分析。根據(jù)模式方程(2),固定其中一個變量在預(yù)定的最優(yōu)條件,STATISTICA軟件包生成了3個三維響應(yīng)面(圖4~圖6)。從圖4、圖5可以看出,以南瓜木葡聚糖得率為響應(yīng)值,因素液料比和提取時間,液料比和NaOH濃度間都在切面上成拋物線趨勢,二者之間具有明顯的交互作用,而圖6中NaOH濃度在切面上成拋物線趨勢,提取時間在切面上成直線趨勢,二者之間也具有明顯的交互作用。綜合上述分析,確定最佳提取條件是液料比為20.1∶1;NaOH濃度為2.7mol/L;提取時間為12.6h。2.2.3木葡聚糖得率檢驗按實驗優(yōu)化條件進行驗證實驗(見表4)的木葡聚糖得率為1.412,與由模式(2)導(dǎo)出的預(yù)測值1.431近似,證明實驗?zāi)Ｊ胶侠?實驗結(jié)果理想。3南果梨木葡聚糖最佳提取工藝的確定為了更好地提高南瓜的附加值,我們利用響應(yīng)曲面法完成了南瓜木葡聚糖的提取優(yōu)化。先前的文獻(xiàn)表明,因為木葡聚糖易通過氫鍵牢牢地與纖維素微纖絲結(jié)合并交聯(lián)成纖維素-木葡聚糖網(wǎng),故常采用濃堿進行提取。在本實驗中,單因素實驗結(jié)果表明,隨著液料比的增加提取得率會增加,但在15倍后增加不明顯;隨著提取時間的增加提取得率會增加,但在12h后增加不明顯。多因素實驗結(jié)果表明,以南瓜木葡聚糖得率為響應(yīng)值,因素液料比和提取時間,液料比和NaOH濃度及NaOH濃度和液料比間交互作用都成拋物線趨勢,二者之間具有明顯的交互作用。運用R2,p水平和學(xué)生氏-t檢驗進行擬合度和顯著性檢驗,最顯著因素為x1x1,然后是x2x2和x2,其t,p分別為(-16.2435,0.00000002;-13.8831,0.00000007和-12.1694,0.00000026)。最佳提取工藝為:液料比20.1∶1;NaOH濃度2.7mol/L;提取時間12.6h。驗證實驗表明,