厭氧真菌木聚糖酶粗酶的提取與性質(zhì)研究

厭氧真菌木聚糖酶粗酶的提取與性質(zhì)研究

木聚糖酶（ec3.2.1.8）可以特異性地分解木聚糖。其產(chǎn)物主要是木槿糖、木糖和阿拉伯糖。由于其抗糧因素（木聚糖）的降低，近年來，作為主要酶的酶制劑，該酶可以廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，并取得了良好的效果。木聚糖酶可由多種微生物產(chǎn)生,目前我國多集中于黑曲霉、木霉等霉菌木聚糖酶的研究。研究表明,厭氧真菌能產(chǎn)生一系列植物細胞壁降解酶,如纖維素酶、半纖維素酶(包括木聚糖酶)、酯酶和植酸酶等,在植物纖維降解中起重要作用。目前來自于好氧霉菌的酶主要只能作用于經(jīng)處理過的非晶體狀底物,而當以濾紙片和麥秸粉作底物時,其降解能力遠不如厭氧真菌產(chǎn)生的酶。本實驗以一株分離自黑白花種公牛糞樣的高產(chǎn)木聚糖酶的厭氧真菌菌株為材料,對其木聚糖酶粗酶的提取方法及其性質(zhì)進行了研究。1材料和方法1.1蘑菇試驗菌株來自南京農(nóng)業(yè)大學消化道微生物實驗室篩選的木聚糖酶高產(chǎn)菌株,編號為A4。1.2培養(yǎng)基po種子培養(yǎng)基每1L含NaHCO35g,葡萄糖1g,酵母膏1g,蛋白胨1g,L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5g,0.1%刃天青1mL,無細胞瘤胃液170mL,緩沖液A(每100mL含KH2PO40.3g,NaCl0.6g,(NH4)2SO40.3g,CaCl2·2H2O0.04g,MgSO4·7H2O0.06g)、B(每100mL含K2HPO4·3H2O0.4g)各165mL。產(chǎn)酶培養(yǎng)基除不含葡萄糖外,其他成分與種子培養(yǎng)基相同。種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基的底物均為稻草片段(小于3mm),其干物質(zhì)含量為8g·L-1。所有培養(yǎng)基均在厭氧條件下制備和分裝,每瓶90mL,加蓋塑膠塞,并以鋁蓋密封后,121℃滅菌15min。進行發(fā)酵實驗時,根據(jù)Zhu等的方法,每瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基接種10mL已生長3d的菌種混合懸浮液,39℃靜止培養(yǎng)96h。1.3配制酸調(diào)節(jié)ph可溶性木聚糖的制備:參照Ghangas等的方法,將燕麥木聚糖(Sigma)制成可溶性木聚糖溶液,并用1mol·L-1的乙酸調(diào)節(jié)pH至7,所得溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｄ揪厶敲富盍Φ臏y定:參照Lowe等的測定方法,以含有酶液但不含木聚糖底物的反應(yīng)體系作比色對照。以每分鐘每毫升酶液釋放1μmol木糖的酶量為1個酶活力單位(U·mL-1)。每分鐘每克蛋白釋放1μmol木糖的酶量定義為1個酶比活力單位(U·g-1)。蛋白含量的測定:參照文獻中的Bradford方法,以牛血清清蛋白為標準。1.4下固體木聚糖酶活力的測定發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液經(jīng)過濾,4000g離心15min,收集上清液。分別取50mL上清液,在20℃下加入固體(NH4)2SO4使其飽和度分別為30%、40%、50%、60%、70%和75%,充分混合均勻,4℃下放置12h,4000g離心15min,然后分別測定其上清液及沉淀物中木聚糖酶的酶活力。以上清液及沉淀物中木聚糖酶酶活力的相對大小確定硫酸銨的最佳鹽析用量。1.5粗酶粉的制備按最佳鹽析用量添加(NH4)2SO4于發(fā)酵上清液中,經(jīng)離心得到粗酶沉淀,然后將其于45℃干燥,制成粗酶粉。取適量干燥粗酶粉溶于蒸餾水中,在0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)中透析除鹽,將得到的粗酶透析液用于酶學性質(zhì)研究。1.6對粗酶性質(zhì)的測量1.6.1反應(yīng)溫度對酶促過程的影響將所得粗酶液用0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)適當稀釋后,分別在不同溫度(20～70℃)下反應(yīng)30min,測定其酶活力,以酶活力最高時的溫度為酶促反應(yīng)最適溫度。1.6.2酶促反應(yīng)最適ph的測定將粗酶液分別用不同pH值(pH2.2～8.0)的0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當稀釋后,在各自對應(yīng)的pH下測定其酶活力,以酶活力最高時的pH為酶促反應(yīng)最適pH。1.6.3不同溫度對殘余酶活力的影響將粗酶液用0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)適當稀釋后,分別在37、50、60和80℃下保溫,每隔10min取樣,快速冷卻至室溫后,按常規(guī)方法測定殘存酶活力。1.6.4酶活測定將粗酶液分別用不同pH值(pH2.2～8.0)的0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液,或0.05mol·L-1磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0～11.0)適當稀釋,4℃放置24h后,測定其酶活力。1.6.5初始酶活力測定將粗酶液分別用pH值為3.0、5.0、7.0、8.0的0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當稀釋,37℃下保溫,隔適當時間取樣,快速冷卻至室溫后,按常規(guī)方法測定殘存酶活力,以初始酶活力為對照。1.7數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)用表示。2結(jié)果與分析2.1不同度對木聚糖酶的木聚糖酶活力的影響由表1可見,隨(NH4)2SO4飽和度的增加,上清液中木聚糖酶的酶活力逐漸降低。當(NH4)2SO4飽和度為70%時,沉淀物中木聚糖酶活力最高。2.2粗酶泥的提取發(fā)酵上清液經(jīng)70%(NH4)2SO4鹽析后得粗酶泥,然后在45℃下烘干18h得干粉。酶活力測定表明,該木聚糖酶粗酶的比活力為7562U·g-1。2.3木聚糖酶的特性2.3.1反應(yīng)溫度對酶促反應(yīng)的影響由圖1可見,該酶在0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)環(huán)境下,酶促反應(yīng)30min的最適溫度為50℃。該酶最適反應(yīng)的pH為5.0～6.0。2.3.2不同保溫時間的酶活力變化由圖2可見,該酶在37和50℃時均較為穩(wěn)定,保溫2h酶活力變化較小;在60和80℃保溫10min,酶活力下降很大,尤其在80℃保溫10min后,酶活力只有初始酶活力的5.1%。該酶在pH4.0以下時,活力下降較快,在pH4.0～11.0時,較為穩(wěn)定。2.3.3時,酶活力下降在模擬動物體溫37℃及胃腸道pH值條件下,該酶在pH3.0時,酶活力下降較快;pH5.0～8.0時,穩(wěn)定性較好,尤其在pH7.0時,經(jīng)過24h保溫后,其酶活力依然保留了85%以上(37.69/44.17)(表2)。3木聚糖酶的最適溫度和ph值為5.厭氧真菌可分泌高活性纖維素酶、木聚糖酶和酯酶等多種酶,并在植物纖維降解中起著重要作用。朱偉云等報道分離自動物的厭氧真菌菌株具有較強的降解能力,但有關(guān)其木聚糖酶的研究報道極少。本實驗中厭氧真菌粗酶粉的木聚糖酶比活力為7562U·g-1,高于國內(nèi)已報道的黑曲霉(Aspergillusniger)所產(chǎn)木聚糖酶的比活力(3181U·g-1)。Lee等亦曾報道,瘤胃厭氧真菌產(chǎn)生的木聚糖酶的酶活力,比目前工業(yè)用木聚糖酶制劑生產(chǎn)菌米曲霉(Aspergillusoryzae)所產(chǎn)木聚糖酶的酶活力高3倍。這些結(jié)果均顯示,厭氧真菌是迄今所報道的產(chǎn)木聚糖酶酶活力較高的菌株之一。在本實驗中,厭氧真菌A4菌株所產(chǎn)的木聚糖酶粗酶的酶促反應(yīng)最適作用溫度為50℃,最適作用pH為5.0～6.0,該結(jié)果與國外報道的厭氧真菌菌株Neocallimastixsp.一致,最適作用溫度與大多數(shù)其他來源的木聚糖酶類似。與已報道的木霉(Trichoderma)及黑曲霉(Aspergillusniger)所產(chǎn)木聚糖酶相比,該厭氧真菌所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH更接近中性。在正常體況下,豬和家禽的消化道溫度通常為37～40℃,胃pH1.5～3.5,小腸pH5.0～7.0,大腸接近中性。本實驗結(jié)果表明,厭氧真菌所產(chǎn)的木聚糖酶在37℃環(huán)境條件下穩(wěn)定性較好,在pH4.0～11.0,尤其在pH5.0～8.0范圍內(nèi)能保持較高的酶活力。該結(jié)果說明,動物