木素過(guò)氧化物酶在環(huán)己烷brij30水反膠束體系中的時(shí)間穩(wěn)定性

木素過(guò)氧化物酶在環(huán)己烷brij30水反膠束體系中的時(shí)間穩(wěn)定性

反聚束是由水、表面活性劑和非極性有機(jī)溶劑（油）組成的宏觀、均勻、微觀多相的力學(xué)穩(wěn)定體系。反膠束體系能較好地模擬酶的天然環(huán)境,在此體系中大多數(shù)酶均能保持一定的催化活性和穩(wěn)定性,有的甚至表現(xiàn)出超活性。20多年來(lái),國(guó)內(nèi)外有20多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)50多種酶在反膠束體系中的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了廣泛而深入的研究,并由此形成了一個(gè)新的跨學(xué)科交叉研究領(lǐng)域——膠束酶學(xué)。木素過(guò)氧化物酶(LiP)是1983年從某些白腐菌中(如Phanerochaetechrysosporium中)發(fā)現(xiàn)的一種含有血紅素的過(guò)氧化物酶,在天然高聚物木素和小分子環(huán)境污染物的生物降解過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用[7,8,9,10,11,12,13,14]。因此,LiP的催化性能及機(jī)制研究對(duì)于充分利用自然資源、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、進(jìn)行水體與土壤的生物修復(fù)、實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展等具有十分重要的意義。以往對(duì)LiP的研究多集中在傳統(tǒng)的水介質(zhì)中。近來(lái),人們開(kāi)始研究反膠束介質(zhì)中LiP的催化性能。我們?cè)谘芯糠请x子反膠束介質(zhì)中LiP催化性能時(shí)發(fā)現(xiàn),在由月桂醇聚氧乙烯醚(Brij30)形成的環(huán)己烷/Brij30/水反膠束介質(zhì)中LiP可體現(xiàn)催化活力,但在水/醇/TritonX-100/環(huán)己烷反膠束介質(zhì)中,無(wú)論改變體系的ω0、水相pH、TritonX-100濃度及直鏈醇種類(n=4、5、6、8、12,n為直鏈醇鏈長(zhǎng)碳原子數(shù)),結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)LiP在其中有明顯活力。本文對(duì)LiP可在其中體現(xiàn)活力的環(huán)己烷/Brij30/水反膠束進(jìn)行了初步優(yōu)化并測(cè)定了LiP在其中的時(shí)間穩(wěn)定性;此外還考察了戊醇對(duì)LiP活力的影響,探討了LiP在TritonX-100反膠束中不能體現(xiàn)活力的主要原因。1材料和方法1.1試劑和試劑島津UV-240型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)及其恒溫附件;HZS-H型恒溫水浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。月桂醇聚氧乙烯醚(Brij30)、TritonX-100購(gòu)自Sigma公司;藜蘆醇(VA)購(gòu)自Fluka公司,環(huán)己烷、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、H2O2、戊醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?水為三蒸水。1.2反膠束體系的建立在小錐形瓶中加入一定體積的環(huán)己烷,按所要表面活性劑濃度稱取一定質(zhì)量的某表面活性劑于錐形瓶中,再加入一定體積某pH緩沖液(緩沖液的體積等于按給定水與表面活性劑摩爾比(ω0)計(jì)算所得的總水體積減去酶液和用于引發(fā)酶促反應(yīng)所需的H2O2水溶液體積,實(shí)驗(yàn)中油水比隨ω0而變),振蕩片刻,即形成澄清、透明的反膠束體系。Brij30易形成反膠束,而TritonX-100必須在較高濃度的助表面活性劑存在下才能形成反膠束。1.3由木素氧化酶lip生產(chǎn)產(chǎn)木素過(guò)氧化物酶的菌種、培養(yǎng)條件及其酶的分離純化同文獻(xiàn)。1.4鏈醇對(duì)樣品的影響直接稱取一定量的底物藜蘆醇(VA)溶于上述反膠束體系中,溶解后搖勻(考察直鏈醇影響時(shí)還需加入一定量的直鏈醇)。取一定體積的上述溶液于石英比色皿中,加入一定體積的LiP酶液并搖勻,在20℃下預(yù)熱2min,以10mmol/LH2O2水溶液引發(fā),在分光光度計(jì)上記錄310nm處吸光度A隨時(shí)間t變化的曲線。1.5lip催化活力藜蘆醇是木素過(guò)氧化物酶的最適底物,在過(guò)氧化氫存在下,其LiP氧化產(chǎn)物為藜蘆醛,后者在310nm處有較強(qiáng)的光吸收(ε=9.3×103L·mol-1·cm-1)。文中所示LiP催化活力均是基于310nm處A～t曲線。由初始直線的斜率經(jīng)吸光度/濃度換算求出反應(yīng)初速率υ0(單位μmol·L-1·min-1)。2結(jié)果與討論2.130個(gè)特洛伊木馬結(jié)構(gòu)的優(yōu)化2.1.1影響酶催化活性的因素水與表面活性劑的摩爾比(ω0)決定反膠束的大小,它是影響反膠束中酶催化活力的主要因素。Brij30反膠束中LiP催化VA氧化反應(yīng)初速率υ0隨ω0值的變化如圖1所示,曲線呈鐘罩形,最佳ω0值在8.5左右。2.1.2反膠束酸緩沖液ph的影響實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),在pH4.2～2.2范圍內(nèi),隨著緩沖液pH值的降低,LiP活力逐漸升高。由于0.1mol/L的檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖體系最高酸度只能配到pH2.2,為此采用了0.1mol/L的鹽酸溶液代替緩沖液,結(jié)果LiP仍能體現(xiàn)活力,反應(yīng)初速率為1.613μmol/(L·min)。進(jìn)一步提高鹽酸濃度會(huì)使體系混濁而無(wú)法測(cè)定。在以后的實(shí)驗(yàn)中我們選用pH2.2的緩沖液。在水介質(zhì)中,LiP最佳酶活對(duì)應(yīng)的緩沖液pH為3.5,而在Brij30反膠束中則為pH2.2。很顯然,這與反膠束中LiP分子周圍的聚氧乙烯鏈頭基有關(guān);醚氧的質(zhì)子化使LiP分子感受到的實(shí)際pH大大降低。2.1.3表面活性劑濃度對(duì)反膠束中va含量的影響B(tài)rij30濃度對(duì)LiP活力的影響見(jiàn)圖3,曲線呈鐘罩形,最佳表面活性劑濃度約為600mmol/L。在恒定ω0下,改變表面活性劑濃度(也就是改變體系的水含量)會(huì)導(dǎo)致反膠束個(gè)數(shù)的增減。上述表面活性劑濃度的影響曲線主要是由反膠束中LiP分子感受到的VA濃度所決定。反膠束中VA的濃度取決于如下兩方面因素:一方面,隨著表面活性劑濃度的增加,增溶在每個(gè)反膠束中VA的量下降;另一方面,含水量的增加又會(huì)增加VA從油相分配到反膠束擬相中的量。2.2brij30反膠束中l(wèi)ip的穩(wěn)定性在最佳介質(zhì)條件下測(cè)定了LiP在Brij30反膠束中的時(shí)間穩(wěn)定性。由圖4可見(jiàn),半衰期在50h左右。水介質(zhì)中,LiP的穩(wěn)定性隨酸度的增加變差。在pH3.0的水介質(zhì)中,LiP的半衰期約為1h;據(jù)此可推測(cè)在pH=2.2的水介質(zhì)中LiP的時(shí)間穩(wěn)定性會(huì)更差。可見(jiàn)LiP在Brij30反膠束中的穩(wěn)定性得到了大幅度提高。這種提高很可能與反膠束界面對(duì)LiP構(gòu)象的束縛作用有關(guān)。2.3戊醇對(duì)brij30/水體系中l(wèi)ip催化活力的影響由非離子表面活性劑、油和水形成的反膠束或油包水微乳液相區(qū)較小,要擴(kuò)大這一相區(qū),需加助表面活性劑(通常是6～8個(gè)碳的直鏈醇),尤其是對(duì)HLB值較大的非離子表面活性劑(如TritonX-100必須在較高濃度的助表面活性劑的存在下才能形成反膠束),為此,本文還研究了戊醇對(duì)Brij30反膠束中LiP催化活力的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),在Brij30反膠束中,戊醇對(duì)LiP催化活力的影響與反膠束大小有關(guān)。只有在高ω0下戊醇對(duì)LiP活力的影響才比較明顯。在ω0=10時(shí)500mmol/L的戊醇便可使LiP活力完全喪失。我們先前研究發(fā)現(xiàn)LiP在環(huán)己烷/Brij30/水體系中可表現(xiàn)活力,然而在水/醇/TritonX-100/環(huán)己烷體系中,無(wú)論怎樣改變反膠束組分和含量均未發(fā)現(xiàn)LiP在其中有明顯活力。由于形成澄清、透明的TritonX-100反膠束所需助表面活性劑醇的濃度通常超過(guò)500mmol/L,因此,推測(cè)高濃度醇對(duì)LiP的失活作用是LiP在TritonX-100反膠束中不能體現(xiàn)活力的主要原因。3lip的穩(wěn)定性在環(huán)己烷/Brij30/水反膠束中LiP