hiv-gag病毒樣顆粒疫苗免疫鼠血清免疫效果的研究

hiv-gag病毒樣顆粒疫苗免疫鼠血清免疫效果的研究

1981年首次發(fā)現這種疾病，共有1400萬人死亡，疫情患者人數接近5000萬人。我國自1994年后HIV感染進入快速增長期,以B、C亞型為主,估計到2010年感染者可能突破1000萬人,所以對HIV-1感染的預防以及與預防相關的問題應該有一個全面的評價,但最實際的需要是證明一種或幾種有希望的候選疫苗能夠進行人體試用。對暴露于HIV-1的個體,包括未采取保護的性伴侶、靜脈途徑的吸毒者和醫(yī)務工作者的自然史研究發(fā)現,人的機體的確產生了保護性免疫應答。HIV-1自然史的許多研究表明,Th1型病毒特異性的細胞介導免疫與免疫保護相關。其它因子如γ干擾素(IFN-γ)、β-趨化因子對遭HIV-1感染有保護作用,其中包括細胞毒性T淋巴細胞活性和CD8病毒抑制活性起重要作用。我們實驗室選用中國流行的HIV-1B、C亞型代表株,將其gag和gp120的V3區(qū)插入gag即gag-V3,以VLP形式在昆蟲細胞中進行了表達。VLP疫苗是目前最有希望的疫苗之一,它與天然病毒十分接近,抗原性強,不帶病毒核酸。觀察我國VLP候選疫苗在小鼠的免疫效果包括體液免疫水平和與細胞因子水平相關的細胞免疫水平,對后期VLP疫苗的靈長類實驗具有重要意義。材料和方法1表達抗的制備將表達HIV-1B亞型的gag和gag-V3的重組病毒感染Sf9細胞,72h收獲上清,上清走8%聚丙酰胺電泳,進行Westernblot分析。P55單抗及二抗由NIHAIDSProject贈送。陽性產物經PEG8000濃縮后15%蔗糖墊層超離(100,00g,6h,4℃)收集后,PBS稀釋后離心(16000r/min40min4℃)。得到純的gag和gag-V3蛋白,將其溶在20mmol/LTris-HCLpH7.5,150mmol/LNaCl,2mmol/LEDTA。抗原性檢測用商用P24試劑盒(VIRONOSTIKAHIV-1ANTIGENKIT)。2小鼠被加佐劑免疫4周齡C57B1/6鼠,在0天、28天以不同劑量(50μg、10μg和1μg)的加佐劑組與無佐劑組分別皮下免疫小鼠,14天后眼眶采血。同時取脾臟分離淋巴細胞并培養(yǎng)在1640液體中,37℃培養(yǎng)4天,收上清。3羊抗鼠igg1和igg2a的表達用P24抗原(200ng/孔)、gp120抗原(200ng/孔)分別包被96孔板,羊抗鼠IgG1和IgG2a使用滴度為1∶103。常規(guī)ELISA法檢測IgG1和IgG2a。羊抗鼠IgG1和IgG2a得自德國UniversityofRegensburg。4病毒釋放量檢測抗血清56℃30min滅活,按2倍倍比稀釋后,與20TCID50HIV37℃反應1h。HIV毒株得自我國AIDS患者,為B亞型,實驗室傳代1代,保存1年。將病毒血清混合物接種5×104MT4細胞。37℃CO2潮濕條件下培養(yǎng)6天。用P24試劑盒檢測細胞上清中病毒釋放量。中和滴度被檢測。5細胞因子水平的檢測ENDOGEN試劑盒檢測IL-5和IFN-γ水平。此試劑盒由德國UniversityofRegensburg贈送。結果1gag、gag-vlp抑制劑的純化表達B、C亞型的gag、gag-V3上清。Westernblot結果如圖1。gag和gag-V3在gag陽性血清為二抗條件下,在分子量55kD處均有一特異性條帶。純化后的gag、gag-V3VLP抗原,PAGE膠經考馬斯亮藍染色顯示大約75%純度。P24試劑盒檢測OD值大于3.0。2抗gaggg3個劑量組的比較表140我們分別對50μg、10μg和1μg組的gag、gag-V3VLP與佐劑的關系進行觀察。gag免疫鼠血清(1∶40)抗gagIgG3個劑量組與有無佐劑無關,其差異無顯著性(各組P>0.1)。而gag-V3免疫鼠血清(1∶40)抗gagIgG3個劑量組與佐劑有關,其差異有顯著性(各組P<0.01)(圖2)。同時gag-V3免疫鼠血清(1∶40)抗V3IgG3個劑量組也與佐劑有關,有顯著性差異(各組P=0.01)。3抗3ga、igg2a滴度比較gag和gag-V3VLP(50μg,佐劑)抗血清中,抗gag及抗V3的IgG1、IgG2a滴度均有升高,而IgG2a稍高于IgG1。同時檢測了gag和gag-V350μg組抗體的中和能力,gag和gag-V3中和抗體滴度分別為1∶20和1∶40(表1)。4細胞培養(yǎng)液gag和il-3a表達的ifn-本實驗對gag和gag-V3(50μg,佐劑)組產生的兩因子進行檢測,小鼠脾淋巴細胞(gag)產生的IFN-γ為2400pg/ml,IL-5為400pg/ml;gag-V3產生的IFN-γ為1000pg/ml,IL-5為200pg/ml;對照組IFN-γ是17pg/ml,IL-5是5pg/ml(表2)。免疫原性的確定我們知道Th1細胞能合成IFN-γ、IL-2、LT,Th2細胞能合成IL-4、IL-5、IL-6、TL-10和IL-13。Th1和Th2細胞均能合成TNF-a、IL-3、GM-CSF和分泌巨嗜細胞炎性蛋白。同時Th1和Th2細胞都能輔助B細胞產生抗體,但輔助的性質和強度不同。Th2通過分泌IL-5和IL-4輔助IgG1和IgA的合成;而Th1對IgG1合成有抑制作用,但輔助IgG2a的合成。我們首次對中國流行株HIV-1B亞型gag和gag-V3VLP疫苗的免疫鼠血清中抗體亞型和細胞因子水平進行研究。分析發(fā)現gag和gag-V3免疫鼠血清IgG亞型中IgG1、IgG2a均有不同程度的升高,IgG2a稍高于IgG1。同時與IgG2a合成相關的IFN-γ數量高于與IgG1合成相關的IL-5。表明gag和gag-V3VLP在鼠體內引起Th1/Th2反應,Th1反應稍占優(yōu)勢。有文獻報道,病毒特異性的Th1反應與免疫保護相關。gag和gag-V3產生的抗體對分離于中國AIDS病人的B亞型毒株有中和作用,與文獻報道相符。其抗體中和活性不高可能是由于蛋白不恰當的折疊而致。這個實驗結果表明,gag和gag-V3VLP疫苗產生抗病毒的中和抗體,而且能引起CD4+T細胞的應答,即Th1和Th2免疫應答,Th1免疫應答強于Th2免疫應答。此結果為HIV疫苗進行靈長類實驗打下了基礎。在本研究中,我們也對不同劑量gag和gag-V3與佐劑所產生的IgG1、IgG2a進行了檢測,與上述結果一致。IgG2a升高高于IgG1;gag-V3組IgG1幾乎沒有升高,僅IgG2a升高。這說明gag-V3嵌合蛋白主要產生Th1型免疫應答。細胞因子的產生也應與佐劑相關,但我們對佐劑和非佐劑組檢測卻發(fā)現細胞因子的產生與佐劑的有無并沒有關系?？赡苁怯捎趯w外刺激用的抗原滅菌強度過大導致抗原性不強所至。另外,實驗中發(fā)現gag-V3VLP產生的抗體滴度低于gagVLP抗體滴度(原因不清),同時gag