門靜脈高壓癥時(shí)細(xì)菌移位與內(nèi)毒素血癥和一氧化氮的關(guān)系

門靜脈高壓癥時(shí)細(xì)菌移位與內(nèi)毒素血癥和一氧化氮的關(guān)系

通過研究大鼠肝前門靜脈高壓的動(dòng)物模型，在門靜脈高壓下研究了細(xì)菌位移、內(nèi)毒素血癥和一氧化氮（no）之間的關(guān)系。材料和方法一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用本院動(dòng)物中心提供的SD大鼠,體重250~300g。2.主要試劑和機(jī)器硝酸鑭、巧克力麥康凱瓊脂、左旋精氨酸、單-甲基精氨酸(Sigma,USA)。壓力轉(zhuǎn)換器和透射電子顯微鏡。二、模型4:將左外投射克氏原螯蝦a/d采用門靜脈部分縮窄(PVS)的方法建立門靜脈高壓的動(dòng)物模型。將大鼠隨機(jī)分為4組,每組10只。A組:行假手術(shù),為對照組。除不結(jié)扎門靜脈外,其他操作與模型組相同。皮下注射生理鹽水1ml,1次/d,連續(xù)14d;B組:行PVS,皮下注射與A組相同;C組:行PVS,皮下注射1ml左旋精氨酸300mg/kg,1次/d,連續(xù)14d;D組:行PVS,皮下注射1ml單-甲基精氨酸50mg/kg,1次/d,連續(xù)14d。三、腸之分段與培養(yǎng)術(shù)后第14天,在氨基甲酸乙酯(6mg/kg)的麻醉下,無菌操作取腸系膜淋巴結(jié)和脾,稱重,放入無菌的勻漿器中。測定門靜脈壓力后從下腔靜脈采血,最后取末段回腸約1cm,放入漂洗液中。四、觀察指標(biāo)和方法1.通過觀察腹部和身體的變化觀察胃腸道瘀血程度,門體側(cè)支循環(huán)形成的情況。2.門靜脈壓測量連接塑料管的4號半靜脈針,充以滅菌肝素鹽水。穿刺門靜脈,從多導(dǎo)記錄儀上讀取數(shù)據(jù),以cm?H2O表示。3.培養(yǎng)菌株的制備在放入淋巴結(jié)和等重量脾的勻漿器中加入0.5ml無菌的液體培養(yǎng)基,勻漿,取上清放入巧克力麥康凱培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)48h。另取1ml血放入血培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)48h,而后行菌落計(jì)數(shù)和菌種鑒別。4.血液中毒素的測定采用偶氮顯色鱟試驗(yàn)方法測定內(nèi)毒素水平。5.血液中的no2-試驗(yàn)采用微量比色法。6.透射電鏡觀察將末段回腸標(biāo)本在含0.1mmol/L二甲砷酸鈉和2%戊二醛中切成1mm3的小塊,放入含鑭的固定液中浸泡、固定、脫水、包埋,超薄切片不染色,透射電鏡下觀察。7.統(tǒng)計(jì)評估用方差分析或χ2檢驗(yàn)及多因素相關(guān)分析判定變量之間的關(guān)系。結(jié)果一、腹部和腹部變化的肉眼觀察PVS各組(B、C和D組)有胃腸道瘀血,腸系膜靜脈擴(kuò)張,側(cè)支循環(huán)形成,脾增大,A組則正常。二、門靜脈壓力術(shù)后第14天,PVS各組門靜脈壓力均較A組高,A組為(3.68±0.21)cm?H2O、B組為(5.92±0.18)cm?H2O、C組為(7.05±0.32)cm?H2O、D組為(4.22±0.29)cm?H2O,P值均<0.01,D組較B組的門靜脈壓力低(P<0.05)。三、革蘭陰性細(xì)菌、分離和感染對pvs檢出率的影響PVS各組腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)菌檢出率均高于A組(A組:20%;B組:76%;C組:69%;D組:71%,P值均<0.01),PVS各組間檢出率差異無顯著意義(P值均>0.05)。脾和血液培養(yǎng)均為陰性。對檢出的細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定,均為革蘭陰性細(xì)菌。菌種和所占比例為:A組:大腸桿菌占70%、變形桿菌占30%;PVS各組:大腸桿菌占33%、腸球菌占15%、變形桿菌占12%、克雷氏菌占20%、假單胞菌占10%。四、組eu/ml,p值比較PVS各組的血內(nèi)毒素值均比A組高,A組:(0.28±0.08)EU/ml;B組:(0.54±0.08)EU/ml;C組:(0.55±0.06)EU/ml;D組:(0.48±0.07)EU/ml,P值均<0.01。PVS各組之間差異無顯著意義(P值均>0.05)。五、c組與b組PVS各組血NO2-值均顯著高于A組,A組:(5.12±0.29)μmol/L;B組:(9.23±0.19)μmol/L;C組:(10.33±0.27)μmol/L;D組:(7.51±0.18)μmol/L,P值均<0.01,C組與B組之間差異無顯著意義(P>0.05)。D組較B組低(P<0.01)。六、血no2-水平細(xì)菌移位率、血內(nèi)毒素和門靜脈壓力與血NO2-水平呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.6033、0.6526和0.7251,P值均<0.05)。七、間質(zhì)細(xì)胞的分布PVS各組腸粘膜上皮細(xì)胞的微絨毛變得短而稀疏,可見電子致密度高的鑭顆粒沉積在腸粘膜上皮細(xì)胞及下面固有層的間質(zhì)細(xì)胞間,呈線條狀分布,線條的粗細(xì)不盡相等,呈彎曲或纏繞成不規(guī)則圈網(wǎng)狀;在間質(zhì)細(xì)胞的各種連結(jié)處也可見鑭顆粒沉淀;也可見鑭顆粒沿著腸粘膜上皮細(xì)胞間分布,見圖1~6。A組則未發(fā)現(xiàn)上述變化。門靜脈高壓可引起細(xì)菌位移和內(nèi)毒素血近年來,腸道細(xì)菌移位引起的腸源性感染作為重要的病理現(xiàn)象得到了廣泛的關(guān)注。Berg等將細(xì)菌移位定義為細(xì)菌通過腸粘膜上皮進(jìn)入固有層然后到腸系膜淋巴結(jié)和其他器官。Alexander等進(jìn)一步提出腸道微生物和細(xì)菌產(chǎn)物,如內(nèi)毒素,都可通過腸粘膜屏障。本研究中腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)菌移位率明顯升高,血中內(nèi)毒素水平也顯著增加,而脾和血中未檢出細(xì)菌,說明在門靜脈高壓狀態(tài)下的腸道改變可引起細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥。對照組也有一定程度的細(xì)菌移位,可能與手術(shù)應(yīng)激有關(guān)。腸道粘膜是防止細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥的主要屏障。目前認(rèn)為各種理化因素和病理原因造成腸粘膜通透性增強(qiáng)和結(jié)構(gòu)破壞可能是導(dǎo)致發(fā)生移位的基本原因。本研究發(fā)現(xiàn)門靜脈高壓可引起腸粘膜屏障的通透性增高。作為示蹤劑的鑭直徑為4nm,在正常情況下不能進(jìn)入細(xì)胞;當(dāng)細(xì)胞膜通透性改變后,即細(xì)胞孔徑增大后才能進(jìn)入細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道,腸上皮細(xì)胞通過刷狀緣的微絨毛吸收或吞噬物質(zhì)后,通過其底部或與其他細(xì)胞的連結(jié)處排出,進(jìn)入固有層細(xì)胞,進(jìn)一步進(jìn)入微靜脈或小淋巴管。本研究中鑭侵入門靜脈高壓組的固有層,說明屏障通透性已增高。粘膜上皮細(xì)胞的微絨毛呈明顯受損的改變,這種改變可能是通透性增強(qiáng)所導(dǎo)致的,使粘膜細(xì)胞對外源性抗原的阻礙力下降,使細(xì)菌和內(nèi)毒素易于穿過腸粘膜屏障。本研究結(jié)果顯