第2章-基因工程原理及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用(第一節(jié)課程回顧)

課程回顧

（一）基因工程的定義1.基因（gene）DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)最小功能單位。2.基因組（geneome）基因組是指一個物種的單倍體的染色體所攜帶的全部基因。一、基因工程的定義3.基因表達（geneexpression）遺傳信息轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。（1）轉(zhuǎn)錄。在DNA分子上合成出與其核苷酸順序相對應(yīng)的RNA的過程。（2）翻譯。在RNA的控制下，根據(jù)核苷酸鏈上每三個核苷酸決定一個氨基酸的三聯(lián)體密碼規(guī)則，合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)肽鏈過程。（3）逆轉(zhuǎn)錄。以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過程。4.重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique）

利用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同的DNA進行體外切割、連接構(gòu)成新的DNA分子的技術(shù)。5.基因工程（geneengineering）以分子遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，利用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)分離出來，在體外進行切割、拼接和重組。然后將重組的DNA導(dǎo)入某種宿主細(xì)胞中，從而改變它們的遺傳性質(zhì)；也可以使新的遺傳信息在新的宿主細(xì)胞中大量表達，以獲得基因產(chǎn)物（多肽或蛋白質(zhì)）。這種創(chuàng)新新生物并賦予新生物以特殊功能的過程就稱為基因工程。6.食品基因工程利用基因工程的技術(shù)和手段，在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，以改良食品的品質(zhì)和性狀，提高食品的營養(yǎng)價值、貯藏價格性狀以及感官性狀的技術(shù)。（二）基因工程的三大理論和三大技術(shù)基礎(chǔ)1.三大理論基礎(chǔ)（1）20世紀(jì)40年代Avery等人的肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA。（2）20世紀(jì)50年代Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)及DNA半保留復(fù)制機理。（3）20世紀(jì)60年代Crick關(guān)于遺傳中心法則的確立，即生物體中遺傳信息是按DNA→RNA→蛋白質(zhì)方向進行傳遞。2.三大技術(shù)基礎(chǔ)（1）如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需要的基因片段切割下來--“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶的發(fā)明（2）如何將切割下來的基因片段進行繁殖擴增--載體(“交通工具車子”)－基因工程技術(shù)誕生的第二個技術(shù)準(zhǔn)備（基因載體）。（3）逆轉(zhuǎn)錄酶－1970年Baltimove和Temin等同時各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學(xué)（生物學(xué)）中心法則，使真核基因的制備成為可能。二、基因工程的工具酶

工具酶：基因工程的操作，是依賴于一些重要的酶（例如，限制酶、聚合酶、連接酶等）作為工具來對基因進行切割和拼接等操作，這些酶被稱為工具酶。

(一)．限制性核酸內(nèi)切酶1.限制酶的概念（定義，分類，命名，限制與修飾辨正關(guān)系）1.1定義限制酶（restrictionendonuclease,restrctionenzymes）是一類專門切割DNA的酶，它們能特異結(jié)合一段被稱為限制酶識別順序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。1.2分類限制酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的（400多種E/350M）。所有的限制酶可分成3類。

（1）Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制與修飾活性，它們識別與切割順序不在一個地方，不產(chǎn)生特異性的DNA片段，與基因工程意義不大（有說Ⅲ型識別核切割的位點一致，但罕見）。

（2）Ⅱ型基因工程說到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此類酶的微生物限制－修飾系統(tǒng)分別由限制酶核甲基化酶來完成。Ⅱ型酶分子量小，僅需Mg2＋作為催化反應(yīng)的輔因子，識別與切割位點相同，產(chǎn)生特異的DNA片段。2.限制酶的切割位點：限制性對dsDNA2條鏈同時切割（其具體切割點，即磷酸二酯鍵斷開的位點，相對二重對稱軸的位置而異）產(chǎn)生3種不同切口：1．

形成平頭末端（flush或bluntend）在識別序列對稱軸處平齊切割DNA兩條鏈而形成的平頭雙鏈末端。如－TC↓GA-smaⅠbsuRⅠor–TC3ˊ+5ˊGA-－AG↓CT-AluⅠ-AG5ˊ+3ˊCT-2.形成5′－粘性末端（5′－cohesiveend即3′延伸末端）5′-GAATTC3′EcoRⅠ5′-GAATTC-3′+3′-CTTAAG5′3′-CTTAAG-5′3.形成3′－粘性末端（3′－cohesiveend）5′CTGCAG3′pstⅠG-3′5′-CTGCA+3′GACGTC5′ACGTC-5′3′-G粘性末端（stickyend）—限制酶切割DNA雙鏈而形成彼此互補的單鏈末端。表2-1限制性內(nèi)切核酸酶的類型及主要特性

主要特性Ⅰ型

Ⅱ型

Ⅲ型

酶蛋白構(gòu)成三種不同亞基兩個相同亞基兩種不同亞基酶活輔助因子ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+識別序列特性EcoBⅠ:TGAN8TGCTEcoKⅠ:AACN6GTGC旋轉(zhuǎn)對稱EcoPⅠ:AGACCEcoP15Ⅰ:CAGCAG切割位點距其特異識別位點至少1000bp處隨機切割在特異切割位點上或其附近特異切割距其識別位點3’端24～26bp處特異切割(二)．DNA連接酶：DNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAligase.1.功能：催化有互補順序的兩個dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′－OH、5′－P連接作用。2.來源－噬菌體T4感染Ecoli分離的一種單鏈多肽酶、MW.68KD（1KD=1000道爾頓）。3.催化反應(yīng)：

（1）需要ATP、Mg2+作輔助因子；（2）缺刻（Nick）DNA也可作該酶的底物。（3）對粘性末端催化活性大于平頭末端（酶量1：100）(三)、逆轉(zhuǎn)錄酶1.概述

逆轉(zhuǎn)錄酶也稱反轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase,RDDP）。2.功能基因工程中主要用于逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA（complementoryDNA）。使用該酶可以獲得目的基因，也可以用來標(biāo)記cDNA作為放射性探針.3.商品化逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種

①AMV（禽成髓細(xì)胞瘤）②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。三、基因工程的載體

載體（vector）：攜帶外源基因進入受體細(xì)胞的運載工具。

（一）載體的功能

1.運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞

2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴增或表達提供條件（二）載體應(yīng)具備的特征條件1.能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立和穩(wěn)定的自我復(fù)制

2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點

3.長度盡可能小，以提高其載裝能力

4.具有多種單一的酶切位點

5.具有合適的選擇性標(biāo)記

多克隆位點(是包含多個（最多20個）限制性酶切位點的一段很短的DNA序列。)ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記(又稱標(biāo)記基因

)Amppolylinker基因載體按照導(dǎo)入的受體生物，一般可將基因工程載體分為大腸桿菌（原核細(xì)胞）載體、酵母載體、植物載體、動物載體等。一、大腸桿菌載體

1.質(zhì)粒載體1.1定義

質(zhì)粒:質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨立于染色體而自主復(fù)制的共價、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子?！锊皇羌?xì)菌生長所必需的★可賦予細(xì)菌抵御外界因素不利影響的能力★分子量在1-200kb之間（三）載體的分類1.2質(zhì)粒的基本特性一般為雙鏈的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），質(zhì)粒分子的長度一般為1～200kb。不同質(zhì)粒的分子質(zhì)量差異顯著，小質(zhì)粒的分子質(zhì)量約為103KDa，僅能編碼2～3種中等大小的蛋白質(zhì)；而大質(zhì)粒的分子質(zhì)量可達105KDa。（1）自主復(fù)制性

攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori）控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因能獨立于宿主細(xì)胞的染色體DNA而自主復(fù)制（2）不相容性同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒在同一細(xì)菌中不能相容不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒在同一細(xì)菌中可共存

（3）可擴增性

質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類

松弛型復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制（4）可轉(zhuǎn)移性

在天然條件下，大多質(zhì)?？赏ㄟ^細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)。

（a）加入合適的選擇標(biāo)記基因（b）增加或減少合適的酶切位點（c）縮短長度，增加裝載量（d）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝（e）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件現(xiàn)已通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建了許多質(zhì)?？寺≥d體供基因工程應(yīng)用，例如，pBR322、pUC系列等。1.3質(zhì)粒載體人工構(gòu)建1)用限制性內(nèi)切酶消化

DNA樣品2)用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA3)連接樣品DNA和質(zhì)粒DNA的消化