微藻的分類及其在油脂生產中的應用

微藻的分類及其在油脂生產中的應用

藻類是一種具有盛行性的生物。沒有根、莖、葉和其他真正的區(qū)別。生殖器官是一個細胞，通過素食者的素食者和反應培養(yǎng)低等生物。有的藻也無葉綠素不能進行光合作用,或者在無光的條件下失去色素而進行異養(yǎng)生活。大多數(shù)藻類生長在水中,目前全球已知藻種中的70%是微藻。微藻(microalgae)一詞不是分類學名稱,而是指那些需要借助于顯微鏡等工具辨別的微小藻類的總稱。顧名思義,微藻個體微小,一般幾微米至幾十微米;結構多為單細胞或單細胞群體;生長周期短、一般數(shù)小時至幾天?？蓪⑺鼈兌x為一類原核或真核的具有光合作用的微生物,原核微藻如藍藻(blue-greenalgae)或稱為藍細菌(cyanobacteria)和原綠藻(prochloraphytes);真核微藻如綠藻(chlorophyta)和硅藻(bacillriophyta)。它們在自然界分布廣泛,無論是在海洋、淡水湖泊等水域或在干燥的陸地,微藻都能生存。據(jù)估計約有5萬種不同類型的微藻存在,目前約3萬種微藻被人們所認識和研究。很多微藻以中性脂為儲藏物質,中性脂占細胞干重的20%~50%,少數(shù)微藻可達75%。微藻應用于油脂生產具有以下幾點優(yōu)勢:①藻類油脂含量高、環(huán)境適應能力強、生長周期短、光合作用效率高、產量高,單位生產力顯著高于農業(yè)油料作物;②微藻的一生都在水中度過,它們的生長不會與其他油料作物爭奪土地,可以起到緩解食用油脂危機的作用;③可以利用邊際陸地、廢棄湖泊、廢水和CO2,有利環(huán)境治理。因此被認為是最具發(fā)展?jié)摿Φ挠椭Y源,在國際上受到極大關注。本文總結和介紹了微藻油脂的主要研究、應用進展和存在的問題。1藻種的油脂用量很多微藻可誘導大量積累脂,平均總脂含量變化在1%~70%,個別藻甚至可占干重的90%。表1是Mata等調查不同海洋、淡水藻的脂含量和生物質生產力的統(tǒng)計結果,可以看出不同藻種油脂含量差別很大,甚至在同屬內的不同藻種變化范圍也很寬;有的藻種油含量很高,但生物質產量很低[2,6,9,10,11,12,13]。如布朗葡萄藻Botryococcusbraunii油脂含量占細胞干重的75%,但生物質生產力很低;而幾個其它藻,如屬于綠藻類別的小球藻Chlorella雖然脂產量變化在2.0%~63%,但生物質產量和生產力均較高。綠藻是油脂生產較合適的材料,同時具有高產脂和高繁殖力的特點。目前全球多家藻種保藏中心已經(jīng)收集了大量藻種以及培養(yǎng)性狀等信息,并開展了部分微藻的油脂含量、生物量以及生產多不飽和脂肪酸的調查。這些資料為篩選高產藻株提供了材料基礎,但目前關于微藻油脂代謝和積累的資料很少,限制了這類資源的應用。2紅藻類、黃藻、隱藻的營養(yǎng)成分微藻油脂是保健品、醫(yī)藥和化妝品的添加劑,也可以作為食用油和可再生能源。人類常食用的植物油脂主要含有5種脂肪酸,其中飽和脂肪酸包括棕櫚酸與硬脂酸,不飽和脂肪酸主要是油酸、亞油酸與亞麻酸,缺少18碳以上的長鏈多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUFAs)。低等藻類和部分微生物具有合成此類多不飽和脂肪酸的功能,目前多不飽和脂肪酸的主要來源-深海魚油也是二級生產者,海洋微藻是這些物質的初級生產者,生活在海洋中的魚類以微藻為食物,因而積累長鏈多不飽和脂肪酸。大多數(shù)微藻中含有豐富的PUFAs。從表2可知,所有7個分類門的多數(shù)微藻種都可以生產人類常規(guī)食品中缺少的18C以上的長鏈多不飽和脂肪酸,如綠藻門的種類C18∶3(n-3)含量高;C16∶3(n-4)是硅藻類的特征成份,C18∶4(n-3)、C22∶6(n-3)是金藻類的主要成份;甲藻含有C18∶4(n-3)、C18∶5(n-3)、C20∶3(n-6)、C22∶6(n-3),紅藻類含有C20∶4(n-6)、C20∶5(n-3);黃藻以EPA(eicosapentaenoicacid,C20∶5n-3)和C18∶4(n-3)為主要成分,隱藻含有C18∶3(n-3)、C18∶4(n-3)、C20∶5(n-3)稀有不飽和脂肪酸[17,18,19,20,21,22]。這些多不飽和脂肪酸是人體必須的營養(yǎng)物質,在人體內有重要的生理功能。比如:n-3系列脂肪酸對腦和視網(wǎng)膜、皮膚和腎功能的健全來說十分重要,DHA(docosahexaenoicacids,C22∶6n-3)和AA(arachidonicacid,C20∶4n-6)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜的重要結構脂成分,在嬰兒的腦組織和視網(wǎng)膜內高度聚集,被人們稱為腦白金,對于神經(jīng)系統(tǒng)有重要的功能,具有健腦、提高記憶力和視力的功能,尤其它可以促進胎兒腦細胞發(fā)育和嬰幼兒腦細胞生長,促進青少年提高記憶,防治老年性癡呆。而EPA不但可以防止血小板沉著于血管壁、阻斷因脂質浸潤所起的內皮細胞損傷和管壁增厚等動脈粥樣硬化的病理過程,還是前列腺素、白細胞三烯、血栓烷和大量二十碳和二十二碳化合物的前體物質,具有特定的營養(yǎng)價值和醫(yī)療營養(yǎng)價值。多不飽和脂肪酸還具有抗炎癥、抗腫瘤、調節(jié)血脂、提高免疫力、預防心血管疾病及治療精神分裂病等多種生理功能。有效的補充PUFAs還可以改善精神分裂癥狀、治療皮膚病等。目前GLA(gamma-linolenicacid,C18∶3n-6)、AA在醫(yī)學領域運用相當廣泛,對治療高血壓、阻止受孕、緩解支氣管哮喘、鼻充血以及消化系統(tǒng)潰瘍等疾病療效十分顯著。除用于保健、食用和醫(yī)用外,微藻油脂還是優(yōu)質的航空用燃料。美國、德國均已成功以微藻油代替航空煤油作為飛機燃料,不需要改造飛機引擎構造即可直接使用。微藻油脂能源含量比傳統(tǒng)飛機燃料高10%,而且燃燒更徹底,可以減少飛機引擎廢氣排放量。美國航空公司協(xié)會(ATA)計劃在2012年以前將海藻油脂等替代能源使用率提高至10%,現(xiàn)在主要有夏威夷Cyanotech公司生產海藻油,但產量很低。利用微藻生產油脂、制備生物柴油是當前最受關注的用途之一,目前作為生物柴油生產原料的微藻有綠藻、硅藻和部分藍藻。幾個含油量高的藻種如角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)和陸茲爾巴夫藻CS182(Pavlovalutheri)、原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)、紫球藻(Porphyridiumcruentum)、舟形藻(NaviculajeffreyiHallegraeffetBurford)常用于試驗和應用。微藻油脂成分與植物相似,無需改造即可通過轉酯化反應生產生物柴油,但目前仍然存在生產成本高等問題,多國科學家正在致力于運用基因工程等生物技術改造微藻,不久將會實現(xiàn)微藻油脂的能源化目標。3微藻及種子植物脂代謝相關酶系統(tǒng)藻類能在廣泛的環(huán)境條件下生存和繁殖,反映了它們的生物多樣性,也反映了細胞內脂肪不同尋常的變化模式,同時也說明藻類細胞在應對環(huán)境條件改變時能有效地調整脂肪的代謝。在最佳生長條件下,藻類合成的脂肪酸主要是用于合成以甘油為骨架的膜脂,膜脂通常占細胞干重的5%~20%。脂肪酸包括中鏈(C10~C14)、長鏈(C16~C18)和超長鏈(≥C20)脂肪酸以及衍生物。當處于不利的環(huán)境條件或在脅迫條件下生長時,許多藻類會改變脂肪合成通路,朝著中性脂肪形成和積累的方向進行,主要是以三酰甘油(TAG)的形式積累。與膜系統(tǒng)中的甘油脂不同的是,TAG主要是作為碳源和能量的一種儲存形式。關于植物的脂代謝研究很多,許多編碼甘油脂合成和脂肪酸去飽和酶的基因已經(jīng)被鑒定;最近還證明了參加脂代謝的中間物質在質體和內質網(wǎng)之間交換,在擬南芥中已鑒定出參加脂合成、交換和分解代謝的基因。而藻脂代謝的研究起步較晚,目前研究較好的是單細胞綠藻萊因衣藻Chlamydomonasreinhardtii。萊因衣藻在脅迫條件下可以積累TAG,在培養(yǎng)基中供給脂也可以合成TAG;該藻具有清楚的遺傳背景,基因測序已經(jīng)完成,還建立了突變體庫、RNAi技術和分子圖譜等,使之成為分子技術和代謝工程研究的模式藻種。藻與植物的脂代謝有很多共同的地方,有人推斷脂代謝建立在綠藻葉綠體與植物祖先的共同進化期間,但藻與種子植物脂代謝至少有2個明顯不同的地方:其一植物脂的合成需要在質體和內質網(wǎng)中分步進行,質體已經(jīng)失去從頭至尾合成脂的能力,而綠藻脂的合成全部過程均在質體中進行;其二,綠藻不能合成phosphoglycerolipidphosphatidylcholine(PC),取而代之的是non-phosphorusbetainelipiddiacylglycery1-N,N,N-trimethylhomoserine(DGTS)。PC是植物種子和葉片中脂代謝的中心分子物質,是脂肪酸修飾酶的底物,也是內質網(wǎng)和質體之間的脂傳遞物質。關于微藻包括衣藻TAG的生物化學研究報道很少,有研究指出衣藻脂合成途徑與植物相似。種子植物共同的TAG合成通道是kennedy途徑,近年還發(fā)現(xiàn)一些植物和酵母生物還可以利用磷脂作為脂?；w,二酰甘油作為脂酰基受體,在磷脂二酰甘油脂酰轉移酶(phospholipiddiacylglycerolacyltransferase,PDAT)的催化作用下合成三酰甘油和溶血磷脂。而衣藻不僅使用kennedy途徑合成TAG,也使用這條更改途徑合成TAG。大多數(shù)藻種油產量受環(huán)境壓力調控,說明TAG作為儲藏物質對微藻有重要的作用。最重要的脅迫因子是營養(yǎng)條件,其中氮饑餓影響最顯著。綠藻Neochlorisoleoabundans在限氮條件可積累脂占干重56%,其中80%是TAG;在黃綠藻Nannochloropsis和綠藻Parietochlorisincise中得到相似結果。綠藻Haematococcuspluvialis在無氮培養(yǎng)基中不僅脂含量增加,脂肪酸成分也有所改變(油酸增加)。其它營養(yǎng)成分缺乏也能調控脂積累,如硅元素缺乏引起硅藻Cyclotellacryptica脂含量上升,磷限制可引起一些綠藻TAG和總脂上升,但也是一些藻種脂下降。其它因子如光、溫、生長階段也影響油積累,溫度的影響根據(jù)不同的藻種而異,有上升也有下降的報道;對綠藻Chlorella調高pH抑制細胞循環(huán)導致其脂上升,說明環(huán)境脅迫可能間接地通過抑制生長促進了TAG合成,不是直接作用。高光密度一般不能提高脂含量,但可以使TAG與總脂比率升高;在綠色巴氏杜氏鹽藻中,TAG在高光密度脅迫下積累TAG與β-胡羅卜素相關,說明TAG積累可能有助于保護葉綠體免受光氧化損害。除了在脅迫條件下微藻細胞能提高含油量以外,通過改變微藻的培養(yǎng)方式如異養(yǎng),或通過基因工程的手段也可以在很大程度上提高微藻細胞的含油量。藻在脅迫環(huán)境下誘導產TAG很可能有不同于種子植物的調控機制。4藻體油脂的合成及微藻合成所面臨的潛在問題近50年來針對微藻的經(jīng)濟產品和能源利用方面開展了研究。20世紀60年代日本為了應對第1次石油危機,利用Chlorella進行了大規(guī)模培養(yǎng)實驗,結果顯示該藻具有高脂產率和高效繁殖力,是可再生能源材料的優(yōu)良候選者。美國再生能源國家實驗室在1978-1996年期間專門設立項目開展了微藻作為能源的研究和評估,通過擴大規(guī)模培養(yǎng),認為微藻作為生產能源的原材料理論上是可行的,但需要長期的研究才能達到提高生產力的目的;他們針對微藻遺傳多樣性,篩選在自然界中存在的高產脂的個體;并開展了遺傳操作改良藻種的研究。他們首先從硅藻中克隆了乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)基因,該基因經(jīng)修飾后轉化到小環(huán)藻中,結果ACCase活性提高,但脂質含量未見明顯增加。根據(jù)美國能源部提供的報告,目前正進一步開展修飾表達載體、改變和擴大受體藻的種類等研究,希望通過這些努力,能夠達到提高藻類中脂質含量的目標。ACCase用于植物的油脂含量提高幅度也不大,主要原因可能是異質型ACCase由4個亞基組成,這些亞基分別由3個核基因和1個葉綠體基因編碼,采用基因工程使這些基因在目標生物中同時表達、定位于質體并組裝成一種有活性的結構有很大的難度。同質型硅藻ACCase屬于單亞基酶,遺傳操縱相對簡單,但可能存在反饋抑制作用,問題也尚未解決。目前主要針對幾個模式藻開展研究并建立了遺傳操作技術,如單細胞綠藻Chlamydomonasreinhardtii、多細胞綠藻的Volvoxcarteri、硅藻的Phaeodactylumtricorutum。迄今為止,已經(jīng)發(fā)展了微藻染色體整合、重組篩選、基因敲除技術。最近發(fā)展的衣藻基因沉默技術正在用于功能基因和代謝途徑的研究。對藻細胞施加脅迫條件的研究,如限制氮源的供給,改變光照強度、溫度等,或者通過改變藻株的培養(yǎng)方式等提高含油量也是當前倍受關注的熱點。隨著對藻類生物的興趣不斷增長,還將有新的模式系統(tǒng)建立起來。國內關于微藻基因工程的研究是最近十年發(fā)展起來的。自從1998年國家啟動海洋“863”計劃以來,中國科學院相關研究所和幾所大專院校相繼開展研究。例如,清華大學通過改變小球藻培養(yǎng)方式為異養(yǎng),通過控制生長條件,使細胞脂含量提高了4倍,達干重的55%。山東海洋工程研究院已經(jīng)培養(yǎng)出富含油脂的微藻,含油量可達68%等。其他更多的研究集中在微藻大規(guī)模培養(yǎng)工藝和收集方法上。本實驗室已開展了硫酯酶基因(FatA,FatB)在微藻中的表達研究,已分別從擬南芥、油菜種子和三角褐指藻中克隆到FatA、FatB和Fat基因,構建了原核藍藻和三角褐指藻表達載體,正在這2個宿主中進行表達。同時還開展了微藻中碳