綠茶提取物的制備及其生物活性

綠茶提取物的制備及其生物活性

綠茶是科山茶科的一種干燥的葉子和芽。在中國(guó)，人們不僅把它用作飲料，而且已經(jīng)對(duì)其藥用價(jià)值有了初步的了解?，F(xiàn)代流行病學(xué)研究提示綠茶對(duì)腫瘤發(fā)生有保護(hù)作用;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示其能提高荷瘤小鼠細(xì)胞免疫功能,并對(duì)某些動(dòng)物腫瘤有抑制作用。我院腫瘤研究室用綠茶水煎液制備綠茶提取物,用作腫瘤病人的輔助治療劑,效果良好。文獻(xiàn)報(bào)道綠茶含有13.24%的鞣質(zhì),鞣質(zhì)的生物活性也逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。為了逐步闡明綠茶提取物的化學(xué)組成以控制其質(zhì)量,我們用定性試驗(yàn)檢查了其中的鞣質(zhì),并用絡(luò)合量法和皮粉法測(cè)定了其中總鞣質(zhì)的含量。1對(duì)照品的制備綠茶:購(gòu)自湖北省茶葉公司,產(chǎn)地為湖北宜昌,經(jīng)鑒定為山茶科植物茶Cameliasinensis(L.)O.Ktze.的干燥嫩葉或葉芽;去雜物,研碎過(guò)20目篩,備用。鞣質(zhì)對(duì)照品:市售鞣酸(分析純,C76H52O46)經(jīng)聚酰胺柱層(5%及10%醋酸液洗脫,聚酰胺-6薄膜檢查為單一斑點(diǎn))得純品作為對(duì)照品;聚酰胺-6薄膜:市售層析用;含鉻皮粉(分析純,上海益民皮革廠產(chǎn))于105℃干燥至恒重,密閉備用;0.05mol/LEDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液:按中國(guó)藥典1995年版方法標(biāo)定濃度;氧化鋅(光譜純,倫敦);1mol/L醋酸鋅溶液:用EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定其濃度;氨—氯化銨緩沖溶液(pH值為10):按中國(guó)藥典1995年版方法配制;鉻黑T指示劑:取鉻黑T0.1g,加干燥的純NaCl10g混合研細(xì),密閉備用。所用其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1雙酰胺縮合物的制備取綠茶粗末適量,加5倍量去離子水煎煮30min,重復(fù)3次,合并煎液,過(guò)濾,常壓濃縮至糊狀,加4倍量體積95%乙醇攪拌均勻,滴加1%NaOH溶液調(diào)至pH值為8,密閉靜置過(guò)夜,減壓抽濾,濾液回收乙醇至無(wú)醇味,水溶液置0～4℃冷藏24h,減壓過(guò)濾,濾液常壓濃縮,80℃干燥得棕褐色片狀物,粉碎即得。經(jīng)10次依法制備,綠茶提取物平均得率為(10.3±1.65)%。2.2吸光度測(cè)定金屬酶法取綠茶提取物0.1g,溶于100ml去離子水,用此溶液進(jìn)行以下定性試驗(yàn)。1%FeCl3試液,溶液變成藍(lán)黑色,放置產(chǎn)生藍(lán)黑色沉淀;0.5%明膠溶液,產(chǎn)生白色沉淀;1%Pb(Ac)2試液,產(chǎn)生紅棕色沉淀,沉淀可溶于稀醋酸;飽和溴水,產(chǎn)生橙紅色沉淀;加稀鹽酸共沸,產(chǎn)生暗紅色沉淀。對(duì)以上試液,供試溶液均呈鞣質(zhì)的明顯陽(yáng)性反應(yīng),且顯示有縮合鞣質(zhì)的存在。分別取綠茶提取物30mg、鞣質(zhì)對(duì)照品20mg置試管中,各加丙酮2ml使溶解,吸取上述兩種溶液各10μl,分別點(diǎn)樣于同一聚酰胺-6薄膜上,以5%醋酸液展開(kāi)10cm,待薄膜干后,用氯化鐵-鐵氰化鉀顯色劑噴霧,顯示藍(lán)色斑點(diǎn);綠茶提取物顯示兩個(gè)斑點(diǎn),Rf值分別為0.15和0.31;鞣質(zhì)對(duì)照品顯示一個(gè)斑點(diǎn),Rf值為0.15。薄層層析結(jié)果顯示綠茶提取物中一個(gè)斑點(diǎn)與對(duì)照品相同。2.3脂肪含量測(cè)定2.3.1大體積、ldta-2na標(biāo)準(zhǔn)溶液的合成取于80℃干燥至恒重的綠茶提取物1.5g,精密稱(chēng)定,用去離子水溶解并稀釋至400ml,搖勻,置水浴上溫?zé)嶂?35±2)℃。精密吸取1mol/L醋酸鋅液20ml置500ml容量瓶中,加飽和氨水14ml,搖勻,使白色沉淀溶解,將前液全量緩緩注入容量瓶中,并不斷振搖,加去離子水稀釋至刻度,加畢繼續(xù)振搖1分鐘,置(35±2)℃水浴中繼續(xù)溫?zé)?0min(間歇振搖數(shù)次),取出,冷至室溫,搖勻后過(guò)濾,棄去初濾液,精密吸取續(xù)濾液20ml,置500ml錐形瓶中,加去離子水300ml、pH10氨-氯化銨緩沖液25ml,絡(luò)黑T指示劑0.2g,搖勻,用0.05mol/LEDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由棕紅色變?yōu)榫G色,結(jié)果用空白校正;按下式計(jì)算重量百分?jǐn)?shù)即得。鞣質(zhì)含量(％)=0.1556×25×(V空?V樣)MW樣×100％鞣質(zhì)含量(％)=0.1556×25×(V空-V樣)ΜW樣×100％式中:0.1556為絡(luò)合沉淀劑(Zn2+)的消耗量與鞣質(zhì)含量的關(guān)系常數(shù);V空為空白對(duì)照溶液消耗的EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù);V樣為樣品溶液消耗的EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù);M為EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度;W樣為取樣量(g)。2.3.2皮粉法取于80℃干燥至恒重的綠茶提取物1.5g,精密稱(chēng)定,按中國(guó)藥典方法測(cè)定。2.4樣品測(cè)定及其回收率精密稱(chēng)取同一已知含量(含量為66.70%)的綠茶提取物樣品10份,每份精密加入鞣質(zhì)對(duì)照品適量,分別用兩種含量測(cè)定方法測(cè)定鞣質(zhì)含量,每法測(cè)定5份,并分別計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。2.5個(gè)人信息測(cè)定精密稱(chēng)取同一綠茶提取物樣品10份,分別用兩種含量測(cè)定方法測(cè)定鞣質(zhì)含量,每法測(cè)定5份;結(jié)果:絡(luò)合量法測(cè)得的平均含量為66.60%,RSD為0.46%(n=5);皮粉法測(cè)得的平均含量為64.42%,RSD為2.63%(n=5)。2.6樣品含量的測(cè)量用上述兩法分別測(cè)定3批綠茶提取物樣品中鞣質(zhì)的含量,結(jié)果見(jiàn)表2。3測(cè)定綠茶提取物新型助劑的確定3.1綠茶提取物制備中,加高濃度乙醇可沉淀水提取帶入的樹(shù)脂、蛋白質(zhì)等共存物質(zhì),調(diào)節(jié)pH值至8是為了增加酚類(lèi)物質(zhì)的溶解度;0～4℃冷藏可沉淀除去脂溶性物質(zhì)。所得綠茶提取物及其他兩種沉淀物經(jīng)動(dòng)物抑瘤對(duì)照實(shí)驗(yàn),確定本研究所采用綠茶提取物為綠茶水煎液抑瘤作用的有效部位。3.2經(jīng)預(yù)試驗(yàn)測(cè)定綠茶提取物鞣質(zhì)含量在66%左右,兩種含量測(cè)定方法均要求取供試品含鞣質(zhì)約1g,因此確定取樣量為1.5g。用絡(luò)合量法測(cè)定時(shí),因供試液顏色較深,按文獻(xiàn)方法加入絡(luò)黑T指示劑1ml,滴定終點(diǎn)顏色變化不明顯,故參考有關(guān)文獻(xiàn)將絡(luò)黑T指示劑用量改為0.2g,滴定終點(diǎn)顏色變化改為由棕紅色變?yōu)榫G色,經(jīng)預(yù)試驗(yàn)對(duì)3批樣品各10次測(cè)定,終點(diǎn)顏色變化穩(wěn)定,突躍明顯。對(duì)空白對(duì)照而言,因待測(cè)溶液為無(wú)色,因此終點(diǎn)突躍顏色仍為由紅色變?yōu)樗{(lán)色。3.3由表2可見(jiàn),兩法測(cè)定綠茶提取物鞣質(zhì)含量的平均值基本一致;建議采用具有省時(shí)、簡(jiǎn)便、材料易得、更準(zhǔn)確更精密等優(yōu)點(diǎn)的絡(luò)合量法。3.