響應(yīng)面法優(yōu)化草魚蛋白的二段酶解條件

響應(yīng)面法優(yōu)化草魚蛋白的二段酶解條件

隨著人們健康意識的增強，豐富的魚類、魚類和蝦逐漸從高質(zhì)量的餐桌上分離出來，產(chǎn)品額外價值降低。然而，由于這些魚的蛋白含量豐富，我們對其進行了詳細的加工，提高了其附加值具有重要意義。通過酶分解蛋白質(zhì)來提高產(chǎn)品質(zhì)量。在本研究中，我們選擇了低脂肪魚，并對反應(yīng)進行了兩個橫截面試驗。采用胰酶、口感酶和瓜氨酸酶三種酶法，以測定兩種算法：酶（e）和下（s）的質(zhì)量比、酶解溫度和酶解時間對蛋白質(zhì)利用率和養(yǎng)分得率的影響，為其他蛋白酶解工藝的研究提供參考。1材料和方法1.1患者lavauryne、生物酶和果汁草魚:購于市場(鮮活),去頭、內(nèi)臟,清洗干凈,絞成肉糜,置于-18℃冰箱中冷凍,備用.酶制劑:胰酶購于杭州三葉生物化工廠;風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme500MG)購于Novozymes(諾維信)公司;木瓜蛋白酶購于廣州裕立寶生物科技公司.凝膠層析標準樣品:GlobinⅢ,GlobinⅡ,GlobinⅠ,GlobinⅠ+Ⅲ,GlobinⅠ+Ⅱ和Globin,均購于Amersham公司,其相對分子質(zhì)量分別為2512,6214,8159,10700,14404和16949.其他化學(xué)試劑均為分析純,由廣州梓興化學(xué)試劑公司提供;去離子水為實驗室自制.1.2蛋白質(zhì)測定方法pHS-25數(shù)顯pH計,上海精密科學(xué)儀器有限公司;KND-2C型蛋白質(zhì)測定儀,上海纖檢儀器有限公司;安瑪西亞?KTApurifier高效液相層析系統(tǒng),通用電氣公司.應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件DesignExpert6.0進行響應(yīng)面試驗的設(shè)計及數(shù)據(jù)分析.1.3酶分解過程酶解工藝流程及酶解條件如圖1所示.1.4分析和測量1.4.1蛋白質(zhì)利用率的測定用凱氏定氮法分別測定上清液和酶解液中蛋白氮含量,并按下式計算:蛋白質(zhì)利用率(RP)=上清液蛋白氮量原料總蛋白氮量×100%.1.4.2tca的離心回應(yīng)采用三氯乙酸(TCA)沉淀法與甲醛滴定法相結(jié)合進行測定.酶解,離心,取10mL的上清液加10mL20%(質(zhì)量分數(shù),下同)的TCA,攪勻靜置半小時后在4800r/min下離心10min,所得離心上清液記作上清液(TCA).分別用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定上清液中的總氮含量和氨態(tài)氮含量,則肽氮量和肽得率按下式進行計算:肽氮量=上清液(TCA)總氮量-上清液(TCA)氨態(tài)氮量;肽得率=(RP′)上清液(TCA)肽氮量原料總蛋白氮量×100%.1.4.3柱凈化層析分離取酶解液2mL與等體積緩沖液混合均勻,混合液經(jīng)孔徑為0.20μL的進口濾膜過濾后,準確吸取50μL濾液上柱(Superdex-peptide-10/300-GL玻璃柱)進行層析分離.洗脫液為0.25mol/LNaCl和pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液,流速為0.5mL/min.2應(yīng)用方案的設(shè)計、分析和優(yōu)化2.1模型擬合與方差分析依前期對單酶和雙酶的篩選,為盡量提高蛋白質(zhì)利用率并改善酶解液苦味,第一段酶解選用胰酶和風(fēng)味蛋白酶以質(zhì)量比為4∶1的比例進行復(fù)配,其中胰酶為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶等的復(fù)合酶,可較徹底地打開蛋白質(zhì)折疊,便于其他酶作用;風(fēng)味蛋白酶含內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶,可改善酶解液的苦味.由于水解過程中體系pH值的恒定與否對水解物組分的相對分子質(zhì)量分布和肽得率影響很小,故酶解在自然pH值下進行.第一段酶解選定底物蛋白質(zhì)量濃度為56g/L,以蛋白質(zhì)利用率為響應(yīng)值,試驗因素包括E/S質(zhì)量比(A)(0.10∶100.00～0.40∶100.00)、酶解時間(B)(1.0～6.0h)、酶解溫度(C)(45～60℃).其實驗方案與結(jié)果如表1所示.表2為響應(yīng)面二次模型方差分析.從表2中可以看出模型F值為48.53,表明該模型高度顯著,P<0.05表明總體上模型因素水平項顯著.由統(tǒng)計學(xué)計算得出,模型的確定系數(shù)值為0.9776,說明方程的因變量與全體自變量間線性關(guān)系明顯;模型的變異系數(shù)值為2.30%,說明模型的精密度好.綜合以上各參數(shù)表明該實驗方法可靠,各因素水平區(qū)間設(shè)計合理,因此可用該回歸模型代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析.回歸模型各項的方差分析結(jié)果還表明,A,B,A2,C2,AC,BC項也均為顯著項,可判斷出各具體實驗因子對響應(yīng)值的影響呈非線性關(guān)系.利用旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計軟件得到回歸方程如下:蛋白質(zhì)利用率=74.98+8.22×A+5.77×B+1.29×C-7.82×A2+1.32×B2-9.68×C2-1.04×A×B+2.83×A×C-2.00×B×C.該方程表達了蛋白質(zhì)利用率與各因素之間的變化規(guī)律.圖2分別表示E/S質(zhì)量比與酶解時間、E/S質(zhì)量比與溫度、酶解時間與溫度對蛋白質(zhì)利用率的影響.從圖2(a)來看,隨E/S質(zhì)量比增加蛋白質(zhì)利用率呈上升趨勢,當E/S質(zhì)量比增至0.25∶100后蛋白質(zhì)利用率增加幅度趨向平緩,這是因為當?shù)孜雉~蛋白一定時,所能提供給酶作用的肽鍵數(shù)目是確定的,過多地添加酶對提高蛋白質(zhì)利用率無貢獻.而酶解時間從1～6h過程中,蛋白質(zhì)利用率呈持續(xù)上升趨勢,據(jù)對單酶酶解過程的觀察,蛋白質(zhì)利用率在酶解時間從0～12h過程中大致會經(jīng)歷快速增長(1～6h)、緩慢增長(6～9h)和平衡態(tài)(9～12h)三個階段.這是因為水解初期,底物魚蛋白含量較高、酶活性大、產(chǎn)物少等有利因素使蛋白質(zhì)利用率迅速增大;反應(yīng)進行到6h左右時,可作用底物含量逐步下降,溫度、pH值等因素的影響導(dǎo)致酶活力下降,蛋白質(zhì)利用率增長趨于緩慢;進入平衡階段(約9h)后,阻礙水解反應(yīng)的不利因素進一步發(fā)展,將導(dǎo)致水解速度更加緩慢.而本響應(yīng)面試驗中酶解時間上限設(shè)為6h,故蛋白質(zhì)利用率表現(xiàn)為隨時間延長而持續(xù)增長,與單酶試驗的規(guī)律一致.從圖2(a)還可看出,當E/S質(zhì)量比、酶解時間水平均較高時,蛋白質(zhì)利用率也相對較高,且低E/S質(zhì)量比、長時間與高E/S質(zhì)量比、短時間作用得到的蛋白質(zhì)利用率相近.從成本角度考慮,選擇低E/S質(zhì)量比、長時間的工藝比較經(jīng)濟.從圖2(b)來看,當溫度在53℃時蛋白質(zhì)利用率較高,而E/S質(zhì)量比較高時蛋白質(zhì)利用率高.從圖2(c)來看,蛋白質(zhì)利用率也在約53℃時出現(xiàn)最大值,且在各個溫度水平下,隨酶解時間延長,蛋白質(zhì)利用率也越高.對響應(yīng)面結(jié)果利用軟件進行最優(yōu)化分析,在底物蛋白質(zhì)量濃度為56g/L的條件下,以蛋白質(zhì)利用率最高為評價指標,確定第一段酶解的最優(yōu)條件如下:胰酶與風(fēng)味蛋白酶按4∶1的比例(質(zhì)量比)復(fù)合,E/S質(zhì)量比為0.30∶100,酶解時間為5.90h,酶解溫度為53℃.依此條件進行酶解,得到蛋白質(zhì)利用率的實際值為82.60%,與預(yù)測值83.31%非常接近.這充分反映出該模型具有強大的分析能力,可為實際操作提供良好的指導(dǎo).2.2肽得率的響應(yīng)面分析在第一段酶解響應(yīng)面分析確定的最優(yōu)化條件基礎(chǔ)上進行第二步酶解條件的研究,選定底物蛋白質(zhì)量濃度為56g/L,以肽得率為響應(yīng)值.試驗因素包括E/S質(zhì)量比(0.1∶100～0.25∶100)、酶解時間(1.0～6.0h)、酶解溫度(50～60℃),相應(yīng)的試驗方案及結(jié)果方差分析見表3～4.從表4中可知模型F值為6.11,表明該模型顯著,P<0.05表明總體上模型因素水平值顯著,因此該試驗設(shè)計是可靠的.與第一段酶解擬合出的二次回歸模型不同的是,第二段酶解擬合為2FI模型,即方差來源與A2,B2,C2三個二次項無關(guān).回歸方程各項的方差分析結(jié)果還表明,C,AB,BC也均為顯著項,利用旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計軟件得到肽得率與各因素之間的變化規(guī)律如下式:肽得率=48.48-0.23×A-0.44×B+1.72×C-2.02×A×B+0.016×A×C+1.69×B×C.圖3為肽得率的響應(yīng)面分析.從圖3(a)我們可以看出,當酶解時間處于較低水平時,隨E/S質(zhì)量比增加,肽得率呈上升趨勢,但當酶解時間處于較高水平時,E/S質(zhì)量比增加反而使肽得率降低.這是因為在水解初期,大量底物魚蛋白被迅速水解為小分子肽,使肽得率增加;隨著反應(yīng)進行魚蛋白含量減少,而產(chǎn)物肽含量迅速上升,由于肽鏈比魚蛋白分子短,靈活性高,更易與蛋白酶接觸發(fā)生反應(yīng)而進一步酶解成氨基酸,因而使肽得率降低.另外,從圖3(a)還可以看出,當E/S質(zhì)量比較低時,隨著時間的增加肽得率呈上升趨勢,但當E/S質(zhì)量比較高時,時間增加反而會使肽得率降低.這同樣是因為當酶添加量較多時,酶量相對于底物蛋白過量,肽分子便與底物競爭而被進一步酶解,因而使肽得率減小.從圖3(b)可以看出,溫度升高有利于肽得率的增加,其原因是溫度升高對第一段酶解所加胰酶和風(fēng)味酶有一定熱滅活效果,阻礙其進一步將肽降解為氨基酸,表現(xiàn)為肽得率增加.同時,E/S質(zhì)量比增加導(dǎo)致肽得率降低,這同樣是因為蛋白質(zhì)斷裂為肽的速度小于肽降解成氨基酸的速度.從圖3(c)可以看出,當溫度低時,隨酶解時間增加肽得率有所降低,而溫度較高時,酶解時間增加導(dǎo)致肽得率明顯增加,其原因是溫度較高時蛋白質(zhì)適度變性,空間結(jié)構(gòu)變得松散,有利于木瓜酶接近,故蛋白質(zhì)降解為肽的程度大于肽降解為氨基酸的程度,從而使肽得率增加;而溫度較低時,未被胰酶和風(fēng)味酶降解的蛋白質(zhì)仍維持一定的空間結(jié)構(gòu),難以被木瓜酶接近,故木瓜酶只作用于靈活性大、空間結(jié)構(gòu)較為簡單的肽分子,因而使肽得率降低.對響應(yīng)面結(jié)果利用軟件進行最優(yōu)化分析,在底物蛋白質(zhì)量濃度為56g/L的條件下,以肽得率最高為評價指標,確定第二段酶解的最優(yōu)條件如下:E/S質(zhì)量比為0.12∶100,酶解時間為5.60h,酶解溫度為60℃.在結(jié)合第一段酶解最優(yōu)條件的基礎(chǔ)上進行兩段酶解,最終得到肽得率為55.16%,比預(yù)計值52.55%稍高.說明響應(yīng)面模型可為酶解趨勢作出很好的預(yù)測.2.3相對分子質(zhì)量和多肽含量為了測定酶解液所含組分的相對分子質(zhì)量分布情況,從而得到酶解液中的肽組分含量以進一步驗證響應(yīng)面分析法的準確度.將酶解液上凝膠柱進行分析(凝膠色譜圖略),其分析結(jié)果見表5.從表5可知,草魚酶解液組分按相對分子質(zhì)量大小不同得到7個組分峰,對比標樣計算可知,酶解液中肽組分的相對分子質(zhì)量在714～8790范圍內(nèi).從表5中還可看出,酶解液中相對分子質(zhì)量在3870～8790之間的組分最多(53.25%),即說明酶解液中近乎1/2的組分集中于此分子段范圍內(nèi).通常認為氨基酸殘基數(shù)在4～10之間的肽為寡肽,而大于10個氨基酸殘基的肽定義為多肽,因此可認為酶解液中多肽含量即為53.25%.從凝膠圖譜組分分析來看,除去部分蛋白質(zhì)分子以外,酶解液中多肽含量(53.25%)與通過響應(yīng)面模型所預(yù)測的肽得率(52.55%)非常接近,進一步驗證了響應(yīng)面模型分析的準確性,說明響應(yīng)面分析法在酶解工藝條件篩選中具有很好的應(yīng)用價值.3型的預(yù)測值和預(yù)測值比較采用響應(yīng)面分析法對復(fù)合