腺嘌呤合成腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的克隆與原生質(zhì)體內(nèi)的獲得

腺嘌呤合成腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的克隆與原生質(zhì)體內(nèi)的獲得

s-liszhi-l-a族硫酸（sam）是一種由有機(jī)4價(jià)硫酸組成的磺酸，因此被稱為“活性甲基硫酸”，這結(jié)構(gòu)于1952年由cotoi確定。在生物體內(nèi),SAM是一種重要的中間代謝產(chǎn)物,除了作為主要的甲基供體,還可以作為轉(zhuǎn)硫基、轉(zhuǎn)氨基、轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)核糖基的作用。此外SAM同時(shí)也可以通過(guò)轉(zhuǎn)硫基作用生成谷胱甘肽(GSH)。臨床上,SAM對(duì)于治療抑郁癥、骨關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默氏病等有一定的作用。目前酵母菌是SAM生物合成的主要研究菌株,如強(qiáng)化畢氏酵母過(guò)表達(dá)腺苷甲硫氨酸合成酶來(lái)增加SAM的合成及利用紫外誘變技術(shù)獲得亮氨酸缺陷型的清酒酵母過(guò)表達(dá)釀酒酵母中腺苷甲硫氨酸合成酶來(lái)增加SAM的產(chǎn)量。國(guó)內(nèi)外采用毛霉菌合成SAM的研究較為少見,用腺嘌呤生物合成SAM的研究尚未見報(bào)道。毛霉菌具有生長(zhǎng)迅速,便于收集和工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),且采用毛霉菌利用腺嘌呤合成ATP的工藝已有報(bào)道,ATP為SAM的合成前體物,并且為SAM的合成提供能量。實(shí)驗(yàn)以1株具有轉(zhuǎn)化腺嘌呤生產(chǎn)ATP能力的雅致放射毛霉為出發(fā)菌株,構(gòu)建含釀酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至雅致放射毛霉原生質(zhì)體,構(gòu)建了SAM工程菌,通過(guò)合成SAM的實(shí)驗(yàn),篩選得到1株以腺嘌呤為前體物的生物合成SAM的高產(chǎn)工程菌。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1微生物菌種保藏雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)ZGB1,E.coliDH5α為浙江工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae1964),購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;質(zhì)粒pCB1004-Pgpd由浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院朱廷恒老師饋贈(zèng);pMD19-Tsimplevector,購(gòu)于Takara公司。1.1.2分子試劑和試藥蝸牛酶(BR)、纖維素酶(BR),購(gòu)于藍(lán)堡化學(xué)試劑有限公司;KpnI、BamHI等限制酶、核酸Marker等所有分子試劑,購(gòu)于Takara公司;孟加拉紅,購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司;潮霉素B,購(gòu)于上海寶曼生物科技有限公司;氯仿、異丙醇、乙醇等其他常用試劑,國(guó)產(chǎn)生化或分析純?cè)噭?.1.3培養(yǎng)基的制備高滲緩沖液(mol/L):山梨醇1.0,Tris0.01,pH7.0;轉(zhuǎn)化緩沖液(mol/L):山梨醇1.0,Tris0.01,CaCl20.025,pH7.0;原生質(zhì)體酶解液:纖維素酶2.0%、蝸牛酶0.5%的高滲緩沖液;種子液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,酵母膏5,NaCl5,pH6.0~6.2;種子固體培養(yǎng)基:種子液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂;菌體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,酵母膏3,玉米漿10,NH4Cl3,MgSO4·7H2O1,FeSO4·7H2O0.2,K2HPO4·3H2O3,pH6.0~6.5;固體再生培養(yǎng)基:以高滲緩沖液配制的種子固體培養(yǎng)基;固體抗性培養(yǎng)基:種子固體培養(yǎng)基含潮霉素B400μg/mL,孟加拉紅100μg/mL;SAM合成反應(yīng)體系(g/L):葡萄糖80,K2HPO4·12H2O70,MgSO4·7H2O4,腺嘌呤3,甲硫氨酸4。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1啟動(dòng)子pgpd擴(kuò)增質(zhì)粒pCB1004-Pgpd在Not/BamHI位點(diǎn)處已連接構(gòu)巢曲霉甘油醛3-磷酸脫氫酶基因的強(qiáng)啟動(dòng)子Pgpd,因此將目的基因克隆至該啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn),可以強(qiáng)化目的基因在宿主菌中的表達(dá)。另外該質(zhì)粒同時(shí)含有潮霉素抗性基因hyg和氯霉素抗性基因cat,可以用于轉(zhuǎn)化子的篩選和驗(yàn)證。用Primerpremier軟件對(duì)NCBI報(bào)道的釀酒酵母sam2基因以及質(zhì)粒pCB1004-Pgpd的啟動(dòng)子Pgpd下游多克隆位點(diǎn)和潮霉素抗性基因hyg序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物序列見表1。氯化芐法提取釀酒酵母總DNA,PCR擴(kuò)增sam2基因,T/A克隆至pMD19-Tsimplevector,驗(yàn)證后測(cè)序由生工生物工程(上海)有限公司完成,雙酶切回收目的片段備用。1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建如圖1所示,PCR擴(kuò)增出釀酒酵母中的sam2基因,通過(guò)對(duì)載體與目的片段的BamHI/KpnI的雙酶切,經(jīng)過(guò)T4ligase連接后,構(gòu)建重組質(zhì)粒pCB1004-Pgpd-sam2,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。1.2.3重組質(zhì)粒pc2004-pgpd-sm2的光催化作用培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑在種子液體培養(yǎng)基中,28℃萌發(fā)4h后的毛霉孢子,加入原生質(zhì)體酶解液在30℃酶解處理2.5~3h,獲得毛霉原生質(zhì)體。在100μL原生質(zhì)體(1×106)懸液中,加入10μL(約1~10μg)線性化處理后的重組質(zhì)粒pCB1004-Pgpd-sam2(KpnI酶切),冰浴30min;加入25μLPEG-4000含量為60%的轉(zhuǎn)化緩沖液,冰浴10min;再加入500μLPEG-4000含量為60%的轉(zhuǎn)化緩沖液,室溫放置10min。轉(zhuǎn)化液加入1mL轉(zhuǎn)化緩沖液稀釋后混合于15mL冷卻至60℃左右的固體再生培養(yǎng)基(含潮霉素B400μg/mL,孟加拉紅100μg/mL),覆蓋在固體再生培養(yǎng)平板上,28℃培養(yǎng)6~8d,篩選轉(zhuǎn)化子。挑取固體再生培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出的單菌落,轉(zhuǎn)接于同樣的抗性平板進(jìn)行復(fù)篩,初步認(rèn)為復(fù)篩平板上長(zhǎng)出的菌落為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。1.2.4活性菌體的制備各轉(zhuǎn)化子分別接種斜面,28℃、4d培養(yǎng)得斜面種子;斜面種子接入帶玻珠的30mL無(wú)菌水三角瓶,160r/min搖床振蕩10min,得毛霉孢子懸液;孢子懸液以10%種量接入種子液體培養(yǎng)基,28℃、200r/min搖床培養(yǎng)12h,得液體種子;液體種子以10%種量接入菌體培養(yǎng)基,28℃、200r/min搖床培養(yǎng)12h,得菌體培養(yǎng)液;菌體培養(yǎng)液二層紗布抽濾收集濕菌體,放烘箱65℃干燥2~3h處理,即為活性菌體。合成反應(yīng)體系中加入活性菌體80g/L攪拌均勻,于37℃,160r/min搖床反應(yīng),反應(yīng)12h終止,測(cè)定反應(yīng)液中SAM產(chǎn)量,篩選SAM高產(chǎn)轉(zhuǎn)化子。SAM產(chǎn)量測(cè)定采用高效液相色譜法(HPLC):取反應(yīng)液1mL,在10000r/min,4℃條件下離心5min,上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾得色譜檢樣液。采用InertsilODS-SP柱(5μm,4.6mm×250mm),流動(dòng)相為15%甲醇-85%緩沖液(含0.6%乙酸銨、0.01%辛烷磺酸鈉的水溶液),用甲酸調(diào)至pH3.0,流速0.5mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)254。采用外標(biāo)法以不同SAM濃度標(biāo)樣及其峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到的回歸方程。根據(jù)檢樣中SAM的峰面積,代入回歸方程計(jì)算檢樣中的SAM含量。1.2.5潮霉素抑制劑單次給藥和hyg基因檢測(cè)氯化芐法提取毛霉轉(zhuǎn)化子DNA,以特異性引物samF/samR擴(kuò)增sam2基因,同時(shí)以潮霉素特異性引物hygF/hygR擴(kuò)增hyg基因,1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。1.2.6耐藥基因檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平檢驗(yàn)根據(jù)寶生物公司提供的組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取毛霉出發(fā)菌株和SAM高產(chǎn)轉(zhuǎn)化子的總RNA。使用寶生物公司的PrimeScriptRTreagentKit進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系為:5×PrimeScriptbuffer2μL;oligodTprimer0.5μL;隨機(jī)引物0.5μL;ddH2O3.5μL;PrimeScriptEnzyme0.5μL;總RNA3μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序:37℃15min;85℃5s。獲得cDNA后以特異性引物samF/samR擴(kuò)增sam2基因,1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。翻譯水平檢驗(yàn)采用提取細(xì)胞總蛋白經(jīng)SDS凝膠電泳驗(yàn)證。電泳樣品的制備:將培養(yǎng)獲得的菌體經(jīng)液氮研磨3~5次。菌體粉末溶于PBS緩沖液。菌體經(jīng)超聲破碎儀超聲(3s,9s),超聲時(shí)間為5min。取超聲混合液8000r/min離心5min,取上清液,經(jīng)濃縮離心儀濃縮后加入100μL無(wú)菌水懸浮獲得總蛋白。取20μL蛋白液加入等體積的2×載樣液,沸水浴3min,10000r/min離心3min,取上清液進(jìn)行電泳。1.2.7體外酶促反應(yīng)ames轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌體培養(yǎng)收集后,取1g濕菌體經(jīng)液氮研磨3~5次,磨至細(xì)粉狀。加入5mL含1mol/LDTT溶液50μL的磷酸鉀緩沖液(pH7.9,PBS),漩渦振蕩,低溫超聲破碎菌體,獲得菌體內(nèi)蛋白抽提液,測(cè)定其SAM合成酶的活力。體外酶促反應(yīng)體系1mL中,加入20mmol/L的L-Met,20mmol/L的ATP,8mmol/L的還原型谷胱甘肽,20mmol/L的MgCl2,100mmol/L的KCl及150mmol/L的pH7.4的Tris-HCl和適量的蛋白抽提液,37℃水浴1h,用不加L-Met的反應(yīng)作為空白對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后,加入0.5mL的20%的高氯酸溶液,離心除去沉淀,所得上清液同樣采用HPLC測(cè)定SAM的含量。酶活定義:37℃,1h催化合成1g的SAM所需的酶量為1U。1.2.8原料代謝產(chǎn)物的測(cè)定方法采用篩選獲得的SAM高產(chǎn)轉(zhuǎn)化子,在合成SAM過(guò)程中,定時(shí)檢測(cè)反應(yīng)液中主要原料葡萄糖、腺嘌呤和產(chǎn)物SAM含量,初步研究原料消耗和產(chǎn)物形成規(guī)律。葡萄糖的測(cè)定:采用測(cè)定還原糖的DNS法。腺嘌呤的測(cè)定:取反應(yīng)液500μL,加入500μL1mol/LNaOH溶解腺嘌呤,在10000r/min,4℃條件下離心5min,上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾。測(cè)定采用高效液相色譜法(HPLC)。液相方法與SAM相同.SAM的測(cè)定:見1.2.4。2結(jié)果與分析2.1目的條帶的構(gòu)建氯化芐法提取釀酒酵母基因組,以釀酒酵母基因組為模板,特異性引物samF/samR擴(kuò)增sam2基因。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示,在約1.1~1.2kb處有目的條帶。該目的條帶通過(guò)T-A克隆至pMD19-Tsimplevector,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,獲得白斑陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后經(jīng)BamHI/KpnI雙酶切驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子由上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明,目的條帶長(zhǎng)1155bp,與NCBI上的sam2基因全長(zhǎng)相同,且經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì),序列完全相同。2.2apai/kpni雙酶切電泳結(jié)果用sam2基因和質(zhì)粒pCB1004-Pgpd構(gòu)建重組質(zhì)粒pCB1004-Pgpd-sam2后,重組質(zhì)粒pCB1004-Pgpdsam2用ApaI/KpnI雙酶切,經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖電泳得到兩個(gè)片段,結(jié)果如圖3所示。小片段大小約為1.2kb,與sam2基因大小相似,而大片段約為6.9kb,與質(zhì)粒pCB1004-Pgpd大小相似。結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pCB1004-Pgpd-sam2構(gòu)建成功,可用于后續(xù)導(dǎo)入雅致放射毛霉的實(shí)驗(yàn)中。2.3抗菌劑的篩選轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后及時(shí)挑取長(zhǎng)出的單菌落,轉(zhuǎn)接含有400μg/mL潮霉素B及100μg/mL孟加拉紅的種子固體培養(yǎng)平板,28℃培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)篩,長(zhǎng)出的抗性菌落初步認(rèn)為是轉(zhuǎn)化子。通過(guò)產(chǎn)物合成反應(yīng)測(cè)定各轉(zhuǎn)化子的SAM產(chǎn)量,從挑取的35株轉(zhuǎn)化子中,獲得5株SAM產(chǎn)量高于出發(fā)菌株的轉(zhuǎn)化子,見圖4,其中1~4號(hào)轉(zhuǎn)化子SAM產(chǎn)量最高,產(chǎn)量為1.00g/L,比出發(fā)菌株ZGB1的0.40g/L提高了1.5倍。2.4潮霉素hyg基因擴(kuò)增氯化芐法提取毛霉轉(zhuǎn)化子基因組,以特異性引物samF/samR擴(kuò)增sam2基因,同時(shí)以潮霉素特異性引物hygF/hygR擴(kuò)增潮霉素hyg基因,擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示,sam2擴(kuò)增的結(jié)果在1.1~1.2kb處有目的條帶,且與pCB1004-Pgpd-sam2質(zhì)粒PCR擴(kuò)增的sam2基因大小相同。而擴(kuò)增hyg在1kb處則有一目的條帶,與NCBI上的hyg基因大小相似。2.5pcr檢測(cè)sa大鼠體內(nèi)zbc1的轉(zhuǎn)錄水平分別提取轉(zhuǎn)化子及出發(fā)菌株總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,合成cDNA,后用特異性引物samF/samR擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖6所示。轉(zhuǎn)化子sam2PCR結(jié)果在1.1kb處有1條條帶,與質(zhì)粒pCB1004-Pgpd-sam2為模板擴(kuò)增出的sam2目的片段大小相似,而以出發(fā)菌株ZGB1逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAPCR結(jié)果則在1.1kb處無(wú)目的片段。說(shuō)明釀酒酵母sam2基因已在雅致放射毛霉體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)?？偟鞍捉?jīng)SDS凝膠電泳驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果如圖7所示。圖中1泳道在約42kDa處有一較為深黑色條帶的目的蛋白片段,而對(duì)照2泳道為ZGB1,幾乎無(wú)目的片段條帶,提示sam2基因已在雅致放射毛霉體內(nèi)進(jìn)行翻譯水平的表達(dá)。但sam2基因?yàn)镻gpd啟動(dòng)子啟動(dòng)的組成型表達(dá),無(wú)任何誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo),因而從圖7中目的蛋白條帶的寬度看,其在雅致放射毛霉內(nèi)表達(dá)量比通常文獻(xiàn)報(bào)道的誘導(dǎo)表達(dá)量明顯要少。2.6菌株的酶活力測(cè)定根據(jù)1.2.7方法進(jìn)行SAM合成酶體外酶促的反應(yīng),反應(yīng)1h后終止反應(yīng),測(cè)定其酶活力。結(jié)果如表2所示。與對(duì)照菌株ZGB1相比,轉(zhuǎn)化子的SAM酶活提高了約2.8倍?？梢娪捎谕庠磗am2基因整合至雅致放射毛霉菌體,導(dǎo)致重組菌SAM合成酶活力有顯著的提高。2.7pa采用糖代謝過(guò)氧化系統(tǒng)atp的合成為研究產(chǎn)物合成特性,分別對(duì)轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株ZGB1的產(chǎn)物合成過(guò)程中的葡萄糖、前體物腺嘌呤及產(chǎn)物SAM進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如圖8所示,0~4h時(shí),轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株ZGB1的葡萄糖消耗較大,其可能原因?yàn)槠咸烟墙?jīng)菌體內(nèi)代謝和磷酸化系統(tǒng)合成SAM前體物ATP。作為ATP合成前體物,腺嘌呤于2~8h時(shí)大量消耗,腺嘌呤經(jīng)體內(nèi)酶促反應(yīng)生成AMP、ADP,進(jìn)而生成ATP,因此腺嘌呤利用相對(duì)于葡萄糖的利用具有遲緩性。而0~2h,SAM合成產(chǎn)量很少,也與腺嘌呤消耗較少有關(guān),2~8h時(shí)與腺嘌呤相對(duì)應(yīng)的,其SAM大量合成而在胞外快速積累。8~12h,葡萄糖殘留濃度太低而基本不消耗,與之對(duì)應(yīng)腺嘌呤消耗也較少,而SAM合成也減緩,這為后續(xù)合成工藝的改進(jìn)提供了重要指導(dǎo)。與出發(fā)菌株ZGB1相比,轉(zhuǎn)化子葡萄糖與腺嘌呤的利用率更高,SAM合成量提高了1.5倍。3制備成酶菌株的篩選與活性目前,國(guó)內(nèi)外大多是利用酵母菌和大腸桿菌進(jìn)行S-腺苷甲硫氨酸的生物合成,主要方法包括對(duì)菌株的傳統(tǒng)育種和培養(yǎng)條件的優(yōu)化,或者是通過(guò)遺傳工程來(lái)改造菌株,而利用絲狀真菌進(jìn)行研究及生產(chǎn)SAM尚未見報(bào)道。楊善巖等在雅致放射毛霉體內(nèi)成功表達(dá)釀酒酵母腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因APT1,這為釀酒酵母SAM合成酶基因sam2在雅致放射毛霉菌體的克隆與表達(dá)提供了借鑒。本文通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增釀酒酵母的SAM合成酶基因sam2,并成功構(gòu)建重組載體pCB1004-Pgpd-s