柑橘cirus成熟果實成熟特異性基因克隆與分析

柑橘cirus成熟果實成熟特異性基因克隆與分析

成熟是果實生長發(fā)育的最終階段。隨著各種生理生化反應(yīng)的發(fā)生，如壁莖、清香、果皮和色素的合成，不僅直接關(guān)系到果實的顏色、味道、香味和質(zhì)地，而且還影響水果收獲后的保存和保存性能。分子生物學研究結(jié)果表明:果實成熟是成熟相關(guān)基因表達調(diào)控的結(jié)果。目前,關(guān)于果實成熟分子機理研究較多集中于呼吸躍變型果實,以番茄Lycopersiconesculentum為最。柑橘Citrus是世界性經(jīng)濟果樹,其果實成熟調(diào)控對鮮食、儲藏保鮮及加工品質(zhì)都至關(guān)重要。研究柑橘果實成熟相關(guān)基因的表達及調(diào)控,對揭示果實成熟的分子機制和利用生物技術(shù)提高果實品質(zhì)均有十分重要的意義。目前,有關(guān)柑橘果實成熟相關(guān)基因的研究報道不多,Jacob-Wilk等發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因Thi在柑橘果實發(fā)育過程中隨著成熟度的增加其表達也逐漸增強。Liu等利用cDNA擴增片段長度多態(tài)性(cD-NA-AFLP)技術(shù)分離獲得柑橘果實成熟與衰老過程中特異表達的CitNAC基因。我們前期利用cDNA-AFLP技術(shù)分離獲得了1個成熟相關(guān)基因CsPMEI/InvI片段,并利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)分析了該基因在不同組織器官和不同果實發(fā)育時期的時空表達,發(fā)現(xiàn)該基因為柑橘果實成熟特異表達基因。本研究擬以紐荷爾臍橙Citrussinensis‘Newhall’成熟果實為試材,利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapidamplificationofcDNAends,RACE)克隆CsPMEI/InvI全長cDNA,并進行生物信息學分析與功能預(yù)測,探討該基因在柑橘果實成熟過程中的作用,為柑橘果實成熟機制研究與果實品質(zhì)改良提供依據(jù)。1材料和方法1.1lataqr酶紐荷爾臍橙成熟果實取自浙江省寧波市象山縣試驗站,將果實果肉切成小塊置于盛有液氮的冰壺內(nèi)帶回實驗室,-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆??？寺∮玫拇竽c埃希菌EscherichiacoliTG1為本實驗室保存;LATaq茚R(DRR02AM)酶,載體pMD18-T,凝膠回收試劑盒,DL2000DNAMarker,3′-FullRACECoreSetVer.2.0試劑盒,5′-FullRACEKit試劑盒及高保真PCR試劑盒等購自TaKaRa公司;PCR引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2測試方法1.2.1總rol提取1.2.2racecdna的合成及pcr擴增根據(jù)Zhang等獲得的CsPMEI/InvI基因片段設(shè)計特異引物(表1),由上海生工生物工程(上海)有限公司合成。以成熟果實總RNA為模板,分別參照3′-FullRACECoreSetVer.2.0和5′-FullRACEKit使用說明進行操作合成相應(yīng)的cDNA第1條鏈。以3′RACEcDNA第1條鏈為模板,3RACEUP1/3RACEoutprimer和3RACEUP2/3RACEinterprimer為引物,進行巢式PCR擴增。以5′RACEcDNA第1條鏈為模板,5RACEDP1/5RACEoutprimer為引物,進行PCR擴增。反應(yīng)體系和程序參照試劑盒使用說明。將擴增獲得目標PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、克隆,并送至上海生工生物工程(上海)有限公司測序。1.2.3cspmei基因的長或f分離1.2.4研究和分析氨基酸利用DNAMAN推測CsPMEI/InvI基因編碼的氨基酸序列;利用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站中的BLAST對獲得的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列進行同源性比對;利用InterProScan4.8軟件對CsPMEI/InvI進行保守結(jié)構(gòu)域分析;使用ProtParam分析氨基酸基本成分;利用DNAMAN軟件進行氨基酸同源性比對及繪制系統(tǒng)進化樹;利用SignalIP4.0進行信號肽預(yù)測;利用PredictProtein分析蛋白功能結(jié)構(gòu)域;用SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。2結(jié)果與分析2.1基于cspmie/invi的目標基因pcr擴增以紐荷爾臍橙成熟果實總RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,利用3′RACE技術(shù),分別獲得長度為370bp和196bp的目的條帶(圖1A,B)。利用5′RACE技術(shù),擴增獲得大小為240bp的目的條帶(圖1C)。將已知目標基因片段和3′,5′端序列利用DNAMAN拼接后,獲得目標基因cDNA序列全長,共945bp,命名為CsPMEI/InvI,GenBank登錄號:KC198084。根據(jù)開放性閱讀框(ORF)序列,設(shè)計特異引物,進行高保真PCR,獲得長度為618bp的ORF序列(圖1D),編碼205個氨基酸。2.2cspmei和invmoda序列分析2.2.1cspmiii/invi蛋白表達利用ProtParam軟件分析CsPMEI/InvI所編碼的蛋白質(zhì)相對分子量為22.29kDa,理論等電點為9.84,分子式為C977H1568N296O282S10。InterProScan4.8分析表明:柑橘CsPMEI/InvI屬于InvI/PMEI家族(圖2)。利用PredictProtein分析發(fā)現(xiàn)CsPMEI/InvI多肽鏈含有InvI/PMEI家族中保守的半光氨酸(Cys)殘基(圖3),其中4個Cys殘基形成2個分子內(nèi)二硫鍵,第5個Cys殘基具有1個自由的硫醇基。研究表明,DTT處理可以破壞Cys間形成的分子內(nèi)二硫鍵,從而減輕或使抑制子蛋白失去抑制作用,這說明保守位點Cys可能與抑制子功能有關(guān),而第5個Cys的作用至今還未見報道。此外,利用PredictProtein軟件分析還發(fā)現(xiàn)該蛋白具有一些功能結(jié)構(gòu)域:173~176為cAMP和cGMP-蛋白激酶磷酸化位點;38~40,118~120和202~204為蛋白激酶C磷酸化位點;118~121和153~156為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點;19~24,130~135和165~170為N-?；稽c(圖3)。盡管在獼猴桃Actinidiadeliciosa和無花果Ficusawkeotsang中均報道了一些磷酸化位點,但是其作用目前尚不清楚。SignalIP4.0軟件分析顯示CsPMEI/InvI多肽鏈1~23位氨基酸為信號肽,其分值為0.795,由于在多肽鏈N端24位處存在1個Ala殘基,所以推測在23與24位之間存在1個信號肽的剪切位點,其分值為0.450(圖4)。利用SOPMA軟件預(yù)測CsPMEI/InvI蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),該蛋白由大量的α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β-折疊結(jié)構(gòu)組成,其中α-螺旋結(jié)構(gòu)有143個,占69.76%,無規(guī)則卷曲58個,占28.29%,而β-折疊均有4個,占1.95%(圖5)。由此可知:CsPMEI/InvI蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋存在,與PMEI的二級結(jié)構(gòu)相符合。2.2.2invipti家族將CsPMEI/InvI推導(dǎo)的氨基酸與GenBank中登錄的InvI/PMEI家族中部分物種氨基酸序列進行同源性比對。結(jié)果表明:這些氨基酸的C端序列相對保守,而在N端序列差異較大,并且含有共同的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點[(S/T)XX(R/K)](圖6)。InvIPMEI家族成員間的氨基酸具有不同的同源性,且同源性較低。聚類分析表明:CsPMEI/InvI推導(dǎo)氨基酸和葡萄氨基酸序列屬于一個進化枝,和擬南芥Arabidopsisthaliana屬于同一個分支(圖7)。氨基酸同源矩陣表明:柑橘與InvI/PMEI家族中的擬南芥,葡萄Vitisvinifera,大麥Hordeumvulgare,甜椒Capsicumannuum,煙草Nicotianatabacum,馬鈴薯Solanumphureja,獼猴桃,番茄和甘薯Ipomoeabatatas等植物的氨基酸序列同源性均低于60%,其中與擬南芥PMEI1(NP_192976)的同源性最高,達到58.1%。3cspmiii/invi在柑橘果實發(fā)育成熟過程中的功能性狀研究果實成熟過程中,細胞壁代謝及糖代謝均是影響果實品質(zhì)的重要因素,而果膠甲脂酶(PME)和轉(zhuǎn)化酶(Inv)分別是兩者代謝的重要參與酶,它們的活性受到pH值、二價陽離子和外界環(huán)境的影響。最近研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化酶抑制子(InvI)和果膠甲酯酶抑制子(PMEI)在翻譯后水平上能分別調(diào)控Inv和PME的活性。目前,關(guān)于PMEI和InvI已有較多研究報道。據(jù)報道多種植物如獼猴桃Actinidiachiniensis,馬鈴薯,無花果和香蕉Musasapientum等均存在PMEI。獼猴桃果實PMEI蛋白能專一性抑制PME活性,其編碼基因在果實成熟期表達增強。InvI在杏Prunusarmeniaca,甘薯,番茄和煙草等植物中均有報道。Greiner等將煙草中編碼InvI的cDNA在馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植物中進行表達,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中,低溫誘導(dǎo)還原糖的含量降低了75%,而對馬鈴薯塊莖產(chǎn)量沒有任何影響,表明抑制子對Inv具有抑制作用。PMEI和InvI不僅在基因序列上具有同源性,同時在蛋白結(jié)構(gòu)與功能上也具有相似性。Scognamiglio等從杏成熟果實中分離獲得InvI蛋白,該蛋白能抑制番茄液泡轉(zhuǎn)化酶的活性,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該InvI與PMEI分子量相似,部分氨基酸序列顯示高度同源,在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性能和二硫鍵排布上具有一致性。InvI/PMEI家族成員間的同源性較低,但是PMEI(或InvI)能特異地抑制PME(或Inv)活性。一些研究者認為該家族中保守的Cys可能更多地與InvI的功能有關(guān)。有些研究發(fā)現(xiàn),獼猴桃PMEI的一些氨基酸殘基(Asn101,Asp109,Thr113和Asn147等)通過與PME中的3個芳香氨基酸殘基(Phe80,Tyr135和Trp223)形成分子間氫鍵相互作用,而它們只存在于PMEIs中。目前,InvI與PMEI在柑橘果實發(fā)育成熟過程中的作用還有待研究。利用生物信息學手段對獲得的CsPMEI/InvI全長cDNA進行結(jié)構(gòu)和功能分析、預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白與PMEI具有相似的二級結(jié)構(gòu),即主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)存在;其編碼的氨基酸與擬南芥PMEI1(NP_192976)的氨基酸同源性最高,達到58.1%;而且該蛋白含有InvI/PMEI家族中保守的4個Cys殘基,此外還有1