多孔納米羥基磷灰石-殼聚糖復(fù)合支架的制備及性能評(píng)價(jià)

多孔納米羥基磷灰石-殼聚糖復(fù)合支架的制備及性能評(píng)價(jià)

多段結(jié)構(gòu)的三維支架是組織工程的一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容。理想的骨組織工程支架應(yīng)該能模擬骨組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能。殼聚糖(chitosan,CS)是一種天然可降解多糖,生物相容性好,塑形容易,已廣泛應(yīng)用于組織工程研究。羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)是骨組織的成分。納米HA(nano-HA)除了具有傳統(tǒng)HA的特性外,在理化性質(zhì)和生物學(xué)方面有更大的優(yōu)越性。為了結(jié)合CS和HA兩種材料的優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)在常把兩種材料復(fù)合以得到具有更好性能的材料。傳統(tǒng)的方法是將HA粉體與CS溶液共混,但是nano-HA存在易聚集、分散困難的缺點(diǎn)。原位復(fù)合的方法,是采用預(yù)先配制均一的HA前體-CS反應(yīng)體系,然后在強(qiáng)堿溶液中緩慢反應(yīng),制備的nano-HA-CS棒材具有多層結(jié)構(gòu),nano-HA可均勻分散在復(fù)合材料中。但是這種材料不具有細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)所必需的多孔結(jié)構(gòu)。我們通過將原位復(fù)合和冷凍干燥的方法相結(jié)合,合成了新型nano-HA-CS多孔支架,并對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)和細(xì)胞相容性研究。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和儀器CS(浙江金殼生物化學(xué)有限公司,黏均分子量5.95×105,脫乙酰度90.75%);KH2PO4、Ca(NO3)2·4H2O、NaOH(分析純,天津大學(xué)科威公司);HA粉體(四川新津縣馬龍化工廠);α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國(guó));胎牛血清(Hyclone公司,美國(guó));0.25%胰蛋白酶(Sigma公司,美國(guó))。JSM-6700F型掃描電鏡、JEM-100CXⅡ型透射電鏡(JEOL公司,日本);DMAX/2500/PC型X線衍射儀(Rigaku公司,日本);FTS3000型傅立葉紅外光譜(BIO-RAD公司,美國(guó))。1.2cs-ha凝膠電泳按參考文獻(xiàn)方法,分別稱取一定質(zhì)量的Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4和CS溶解在2.0%的乙酸溶液中并充分?jǐn)嚢?最終配成一定濃度和質(zhì)量比的nano-HA-CS前體溶液(CS濃度,CS-HA理論生成量質(zhì)量比:CS1.0%,CS-HA1∶1;CS1.0%,CS-HA1∶2;CS2.0%,CS-HA2∶1;CS2.0%,CS-HA2∶2;CS3.0%,CS-HA3∶1),離心去氣泡。預(yù)先用少量溶液注入模具,在模具內(nèi)沉積一層CS膜;然后用配制的混合液注滿容器,將容器置入4.0%NaOH溶液中,室溫下反應(yīng)。10h后將反應(yīng)所得的凝膠體浸入去離子水,浸泡至中性,除去殘留的NaOH。將清洗后的凝膠體放入-30℃低溫冰箱預(yù)凍6h,然后進(jìn)行冷凍干燥,制得多孔支架。1.3納米哈氏合金材料的物理和化學(xué)性質(zhì)性能1.3.1微膠囊的觀察將支架用利刀切開,以顯示內(nèi)部結(jié)構(gòu),噴金鍍膜后在JSM-6700F型掃描電鏡下觀察其微觀形貌,JEM-100CXⅡ型透射電鏡觀察HA晶體顆粒大小和分布。1.3.2支架密度和孔隙率采用液體置換法測(cè)定,用量筒量取V1體積的無水乙醇,取一定質(zhì)量(W)的支架浸入其中,反復(fù)抽真空至無氣泡逸出,此時(shí)量筒讀數(shù)是V2,將含乙醇的支架材料移出后記所剩乙醇體積為V3,支架孔隙率(P)可用下式計(jì)算:P=(V1-V3)/(V2-V3),支架的密度d=W/(V2-V3),每種樣品測(cè)6個(gè)。1.3.3支架結(jié)構(gòu)分析DMAX/2500/PC型X線衍射儀、FTS3000型傅立葉紅外光譜分析材料的組成和結(jié)晶結(jié)構(gòu)。1.4細(xì)胞肺癌實(shí)驗(yàn)1.4.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠顱成骨細(xì)胞取大小為5mm×5mm×3mm的nano-HA-CS支架(CS1%,HA-CS1∶1)和純CS支架酒精消毒后備用。提取初生Wistar大鼠顱成骨細(xì)胞(天津利居生物制品供應(yīng)中心),并進(jìn)行傳代培養(yǎng)至第3代。細(xì)胞匯合后,經(jīng)胰酶消化、培養(yǎng)基稀釋,形成密度為1.0×105/ml的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液均勻接種于兩種支架上,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。α-MEM+10%胎牛血清培養(yǎng)液每2天更換1次。1.4.2黏附細(xì)胞的制備細(xì)胞-支架復(fù)合物共培養(yǎng)2、4、6、8h,分別在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出復(fù)合支架和純CS支架各4個(gè)樣品,PBS液沖洗3次,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算黏附細(xì)胞的百分率。1.4.3片、he染色后光鏡觀察將培養(yǎng)5d的樣品經(jīng)過固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后,在光鏡下觀察。經(jīng)過2.5%的甲醛固定和1.0%的鋨酸二次固定,梯度酒精逐級(jí)脫水,真空干燥、噴金后在掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。1.5均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P值<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1“鋪路石”狀的孔壁密度和支架密度的變化掃描電鏡觀察復(fù)合支架具有多孔結(jié)構(gòu)(圖1a～c),孔徑為100～500μm,大多數(shù)孔徑為400～500μm。支架孔內(nèi)無HA晶體聚集,孔壁上有大量細(xì)小的HA晶體連續(xù)、均勻分布,猶如“鋪路石”狀緊密鑲嵌在孔壁上(圖1d)。支架具有很高的孔隙率,而隨著CS和HA含量的增加,支架的孔壁增厚,孔隙率降低,密度升高,見表1。支架的密度、CS和HA總含量不同的支架,兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。支架孔隙率比較,支架(CS1.0%,CS-HA1∶1)與支架(CS2.0%,CS-HA2∶1;CS2.0%,CS-HA2∶2;CS2.0%,CS-HA3∶1)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。透射電鏡觀察,可見大量的HA晶體包裹于CS的基體中,晶體呈球形,直徑為60nm左右,在基體中分散良好(圖2)。2.2復(fù)合支架的紅外光譜X線衍射分析見圖3。在復(fù)合支架衍射譜中可明顯見到與HA特征衍射峰位置相對(duì)應(yīng)的衍射峰。但與HA粉末的衍射譜比較,復(fù)合支架的衍射峰峰形明顯變寬,峰位重疊。隨CS-HA含量和比例的變化,各衍射峰的強(qiáng)度也不同。在復(fù)合支架的紅外光譜中(圖4),除可見HA中PO43-、OH-的特征吸收峰外,在1420cm-1附近還出現(xiàn)了CO32-的吸收峰。而相對(duì)于純CS譜圖,CS酰胺Ⅰ譜帶(1655cm-1)和酰胺Ⅱ譜帶(1596cm-1)的吸收峰在復(fù)合支架的譜圖中向低波數(shù)方向偏移。CS-HA含量和比例不同的支架特征吸收峰的強(qiáng)度也不同。2.3不同支架的黏附率細(xì)胞-支架復(fù)合物共培養(yǎng)4、6、8h,成骨細(xì)胞在nano-HA-CS復(fù)合支架上的黏附率分別為24.25%±2.88%、35.51%±3.81%和67.63%±3.63%,均明顯高于在純CS支架上的黏附率15.34%±2.81%、22.84%±3.02%和46.04%±3.62%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。成骨細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)5d,組織切片HE染色可見梭形的成骨細(xì)胞,核為圓形,黏附生長(zhǎng)于支架孔內(nèi)(圖5)。掃描電鏡觀察可見大量梭形、多角形的成骨細(xì)胞黏附于材料表面,另有大量成骨細(xì)胞開始分泌纖維狀細(xì)胞外基質(zhì),包裹于基質(zhì)中的成骨細(xì)胞呈球形(圖6)。3原位復(fù)合與冷凍干燥法復(fù)合支架的優(yōu)點(diǎn)組織工程的目的是運(yùn)用生命科學(xué)和工程科學(xué)的原理和方法,研究、開發(fā)具有修復(fù)或改善組織或器官功能的新一代臨床應(yīng)用取代物,用于替代組織或器官的一部分或全部功能。骨組織工程為因外傷、骨腫瘤、骨病等造成的骨缺損修復(fù)提供了一條新的解決途徑。支架、種子細(xì)胞、生物活性因子,是組織工程中的關(guān)鍵因素。支架作為種子細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì),新形成的組織框架,其性質(zhì)直接影響細(xì)胞的黏附、增殖和分化等生物學(xué)特性,最終影響組織構(gòu)建。骨組織工程支架材料的要求:應(yīng)具有一定機(jī)械強(qiáng)度,為新生組織提供支撐;具有一定骨傳導(dǎo)性,有利于臨近正常骨組織爬行替代;具有良好的生物相容性,有利于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng);具有良好的生物降解性,能隨新骨形成,逐漸被骨組織替代。結(jié)合兩種材料的優(yōu)點(diǎn),CS-HA復(fù)合材料可以更好滿足上述要求。另外,組織工程支架應(yīng)具有三維多孔結(jié)構(gòu),一定孔徑孔隙率的支架是細(xì)胞與周圍環(huán)境進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換,促進(jìn)骨組織再生、修復(fù)的必要條件。CS-HA復(fù)合材料可以通過冷凍干燥法、粒子瀝濾法等,制備成多孔支架。其中,冷凍干燥法以水為致孔劑,無有機(jī)溶劑殘留,且簡(jiǎn)單、可控,具有一定的優(yōu)越性。骨是一種復(fù)雜的生物礦化體系。生理狀態(tài)的HA晶體極小,尺度在納米級(jí),以有機(jī)質(zhì)形成的網(wǎng)絡(luò)為模板有規(guī)律的沉積,形成連續(xù)的、有支持力的結(jié)構(gòu)。因此,從仿生學(xué)的角度看,應(yīng)當(dāng)保持骨組織替代材料中HA在納米狀態(tài)。我們的實(shí)驗(yàn)通過把原位復(fù)合與冷凍干燥的方法相結(jié)合,解決了傳統(tǒng)方法nano-HA在基體中的分散問題,制備了高孔隙率,大孔nano-HA-CS支架。在原位復(fù)合反應(yīng)中,預(yù)先形成的CS膜具有半透膜作用,可以使-OH向內(nèi)緩慢滲透,進(jìn)而控制CS沉積和HA形成兩個(gè)反應(yīng)有序進(jìn)行,同時(shí)CS可以起到模板的作用指導(dǎo)HA的沉積,最終形成nano-HA分散均勻的復(fù)合物凝膠。再通過預(yù)凍、冰晶致孔,冷凍干燥最終制成多孔支架。制備的復(fù)合支架保持了很高的孔徑和孔隙率,表明大量HA晶體的形成并未影響支架的孔結(jié)構(gòu),這有利于氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)、細(xì)胞的遷移、增殖和分化。有機(jī)質(zhì)對(duì)礦物質(zhì)沉積有指導(dǎo)作用,掃描電鏡和透射電鏡可觀察到,復(fù)合支架的孔壁上有大量納米級(jí)的HA晶體,按CS形成的框架有序沉積,彼此連接,與CS基體結(jié)合緊密,晶體大小與骨組織中的磷灰石類似。nano-HA-CS支架中HA的X線衍射峰峰形變寬,峰位重疊,是因?yàn)樾纬傻腍A晶粒在納米級(jí),且呈弱結(jié)晶狀態(tài)的原因;紅外光譜中出現(xiàn)的CO32-的吸收峰表明合成的是含碳酸納米晶體,其特點(diǎn)與骨組織中HA結(jié)構(gòu)類似。復(fù)合支架紅外光譜中CS的酰胺Ⅰ譜帶和酰胺Ⅱ譜帶向低波數(shù)方向移動(dòng)表明,在原位復(fù)合反應(yīng)過程中HA和CS兩種分子間產(chǎn)生了化學(xué)作用,可能是CS中的-NH2與HA中的-OH之間的氫鍵作用以及-NH2和Ca2+之間的螯合作用引起的,該作用能使CS基體與HA晶體結(jié)合更加牢固,有效限制HA顆粒移位。納米晶體巨大的比表面積,具有晶格缺陷的含CO32-弱結(jié)晶體結(jié)構(gòu),該特點(diǎn)使支架中的nano-HA更易在生理狀態(tài)下溶解,從而提高材料周圍局部的Ca、P離子濃度,有利于在材料表面形成類骨磷灰石層,而表面形成富Ca-P層和類骨磷灰石層是支架材料植入體內(nèi)后形成骨鍵合的關(guān)鍵因素。細(xì)胞相容實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,成骨細(xì)胞能很好地在復(fù)合支架上黏附、增殖,表達(dá)細(xì)胞功能,比在純CS支架上具有更高的細(xì)胞黏附率,更有利于成骨細(xì)胞黏附,這