電針內(nèi)關(guān)穴對大鼠急性心肌缺血的自主神經(jīng)效應(yīng)及可能的物質(zhì)

電針內(nèi)關(guān)穴對大鼠急性心肌缺血的自主神經(jīng)效應(yīng)及可能的物質(zhì)

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，內(nèi)關(guān)-心之間的經(jīng)絡(luò)性質(zhì)與電針內(nèi)關(guān)穴的急性心肌缺血（ami）密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，以電針內(nèi)關(guān)穴為干預(yù)手段，觀察大鼠心感受，迷宮神經(jīng)發(fā)射頻率的變化，以及獨(dú)立神經(jīng)中樞p物質(zhì)（sp）和氧氮基因（nos）的散列值，并將其與正常大鼠和ami模型進(jìn)行比較。以電針內(nèi)關(guān)穴內(nèi)各功能的自我效能路徑和可能有效物質(zhì)進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步探索內(nèi)關(guān)-心之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。材料和方法1.材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠18只,體質(zhì)量180-200g,雌雄不拘,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供,普通級,動(dòng)物合格證號:610103。1.2免疫組織化學(xué)RbXSubstanceP:100μl,購自CHENICONINTNATIONAL(AM.);即用型SABC免疫組化染色試劑盒:購自武漢博士德生物公司;NADPHNa4:25mg,購自Biosharp(AM.);3-3-DAB.4HCl(3-3二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽):1g,購自Amresco,由薈萃生物公司提供;氯化硝基四氮唑藍(lán):250mg,購自科瑞生物公司(上海,英國分裝)。2.方法2.1股靜脈采血試驗(yàn)20%烏拉坦給予大鼠腹腔注射麻醉(5ml/kg),按6U/kg比例股靜脈注入垂體后葉素(pituitary,Pit)注射液(6U/ml,蚌埠市宏業(yè)生化制藥廠,批號020612),觀察心電圖在1min內(nèi)出現(xiàn)心率明顯減慢、T波顯著高聳,或ST段抬高>0.1mV為造模成功。2.2頸下神經(jīng)節(jié)的分離大鼠麻醉后手術(shù)臺(tái)仰臥固定,頸部剪毛,碘伏消毒,在喉頭與胸骨間沿頸正中線作長約2.5-4cm的切口,尋找右側(cè)頸動(dòng)脈鞘(內(nèi)有頸動(dòng)脈及迷走神經(jīng))后,分離出迷走神經(jīng)主干約1-2cm,并以4號線從中間引出備用;在左側(cè)頸總動(dòng)脈后、椎前肌淺面、椎體旁,將椎前筋膜用玻璃分針縱向剝離,找出頸交感干,沿交感干向下找出頸下神經(jīng)節(jié),用細(xì)線穿過神經(jīng)下方引出備用。將分離的右側(cè)迷走神經(jīng)、左側(cè)交感神經(jīng)分別掛上BL-420E+生理儀(成都,泰盟)銀絲電極,記錄神經(jīng)放電情況,記錄中石蠟油濕潤神經(jīng),記錄時(shí)間25min。2.3小鼠海馬的腦室鏡觀察打開大鼠胸腔,經(jīng)升主動(dòng)脈插管,先用0.9%NaCl注射液100ml快速灌注,后用4%多聚甲醛的0.lmol/LPBS液(pH7.4)400ml先快速、后緩慢灌注固定50-60min。灌注完畢立即取完整腦組織及C7-T7段脊髓放入上述相同的新鮮固定液中固定4h,再移入25%蔗糖溶液過夜沉底(4℃),次日取出組織作恒冷箱連續(xù)冠狀切片,片厚40μm。按大鼠腦定位圖譜,留海馬出現(xiàn)至海馬傘體積最大顯示之間切片20張/只;切取延髓第四腦室至中央導(dǎo)水管段留片20張/只;切取脊髓C8-T2段留片20張/只。上述切片0.01mol/LKPBS液4℃保存。2.4sp抗體-igg-sp-100-u切片漂洗(入0.01mol/LKPBS液漂洗10min×3次,下同);浸入80%甲醇雙氧水(雙氧水濃度為0.3%)30min(4℃),漂洗;入含0.3%TritonX-100的0.01mol/L的KPBS緩沖液搖床30min;入SP抗體(稀釋濃度1∶1000)4℃孵育48h,漂洗;入生物素化羊抗兔IgG(稀釋濃度1∶0)4℃孵育12h,漂洗;入SABC復(fù)合水(釋濃度1∶0)4℃孵育12h,漂洗;顯色,漂洗;貼片,干燥;脫水;明膠封片。2.5u3000結(jié)論切片漂洗;入含0.3%TritonX-100的0.01mol/LKPBS緩沖液搖床30min,漂洗;入孵育液(硝基四氮唑藍(lán)2mg溶入含0.3%TritonX-100的0.1mol/LKPBS液10ml中,抽出1ml加入NADPH1mg,37℃2h),漂洗;貼片,干燥;脫水;明膠封片。2.6神經(jīng)放電檢測SD大鼠18只,隨機(jī)分為正常組(A組)、模型對照組(B組)、電針內(nèi)關(guān)組(C組)3組,每組6只。各組處理方法如下:正常組(A組):分離神經(jīng)、記錄神經(jīng)放電,分別于第0、3、8、13、23min標(biāo)記,之后脊髓、腦固定并取材、切片,檢測SP、NOS。模型對照組(B組):分離神經(jīng)、記錄神經(jīng)放電,第3min造模,分別于造模前、造模后0、5、10、20min標(biāo)記,之后組織固定、取材、切片、檢測同A組。電針內(nèi)關(guān)組(C組):分離神經(jīng)、記錄神經(jīng)放電,造模、標(biāo)記同B組,造模后5min針刺左上肢內(nèi)關(guān)穴(參照華興邦“大鼠穴位圖譜”,于尺骨、橈骨縫間離腕關(guān)節(jié)約3mm處取“內(nèi)關(guān)”穴,毫針0.38×15mm)并接G6805-1型電針儀,疏密波(8-80Hz,疏密波轉(zhuǎn)換14次/min,電壓1.5V,強(qiáng)度1mA),電針5min后去電針儀繼續(xù)留針至15min起針。最后組織固定、取材、切片、檢測同A組。2.7延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)及髓外側(cè)角sp、nos灰值的測定依據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道,觀察各組造模前,造模后0、5、10、20min各時(shí)刻迷走神經(jīng)及交感神經(jīng)放電頻率(Hz)。觀測PVN、延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)及脊髓外側(cè)角SP、NOS灰度值。運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)測定其灰度值是對其免疫組化結(jié)果進(jìn)行量化評價(jià)的一種方法,即入射光灰度和它穿過免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物后的灰度之比的對數(shù)值,紅光光密度與其含量呈正比,而綠光和藍(lán)光與其含量呈反比。由于SP免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色,因此,SP光密度值與其含量呈正比,而NOS免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色,故NOS光密度與其含量呈比。3.sp、nos免疫陽性基于c8-木糖的血清因子水平圖像分析采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行,對棕黃色和藍(lán)色雜交信號進(jìn)行灰度掃描。每鼠取下丘腦室旁核(PVN)、延髓迷走神經(jīng)背核、C8-T2各4張,每片于相應(yīng)部位取3個(gè)視野,每項(xiàng)指標(biāo)共12個(gè)視野,分別測定,累加取均值,即為該鼠SP或NOS免疫陽性灰度值。數(shù)據(jù)以x±s表示,組內(nèi)比較、組間比較采用SPSS12.0軟件進(jìn)行方差分析,顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。結(jié)果1.造模前后放電頻率的變化從表1可以看出,造模后各時(shí)刻迷走神經(jīng)放電頻率B組與造模前及A組相應(yīng)時(shí)刻相比顯示差異性(P<0.05),C組造模后0min與造模前及A組放電頻率也顯示差異性(P<0.05),均提示心肌缺血造模后引起迷走神經(jīng)放電頻率增加;C組造模后20min(即電針內(nèi)關(guān)結(jié)束)迷走神經(jīng)放電頻率降低,與組內(nèi)造模前及A組同時(shí)刻比較無差異,與同時(shí)刻B組相比有差異性(P<0.05,提示電針內(nèi)關(guān)穴對急性心肌缺血引起的迷走神經(jīng)放電有抑制效應(yīng)。2.內(nèi)針插入對心臟交感神經(jīng)放電頻率的影響3.組間差異情況從表3可以看出,B組各部位SP灰度值小于A組,并顯示出組間差異性(P<0.05);C組各部位SP含量均高于A、B組,組間比較有差異性(P<0.05),提示電針內(nèi)關(guān)后能提高各部位SP含量。4.電針內(nèi)關(guān)治療對不同部位nos含量的影響由于NOS光密度與其含量呈反比,從表4可以看出,B組各部位NOS含量最低,與A、C組間均顯示出差異性(P<0.05),提示造模后NOS在三部位含量降低,電針內(nèi)關(guān)治療能上調(diào)三部位的NOS的含量。sp、nos模型檢測一般認(rèn)為,延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)(包括迷走神經(jīng)背核、孤束核)是支配心自主神經(jīng)的中樞部位。下丘腦室旁核(PVN)通過下丘腦下行通路使PVN、延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)、脊髓外側(cè)角等部位聯(lián)系起來,在心血管功能活動(dòng)中起到整合作用。近年來研究表明,神經(jīng)肽類物質(zhì)如SP和神經(jīng)遞質(zhì)NO均參與心血管功能活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)。NOS是NO生成過程中的最重要的限速因子,是NO合成的關(guān)鍵酶,因此檢測組織中的NOS可反映NO生成的情況。在電針內(nèi)關(guān)穴引起自主神經(jīng)調(diào)節(jié)抗AMI損傷作用過程中,研究中樞SP、NOS參與機(jī)制對于探討內(nèi)關(guān)-心臟相關(guān)有重要意義。本實(shí)驗(yàn)觀察到,電針AMI模型大鼠內(nèi)關(guān)穴,自主神經(jīng)放電頻率得到不同調(diào)整:迷走神經(jīng)放電頻率降低,交感神經(jīng)放電頻率增高,SP、NOS陽性表達(dá)在PVN、延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)及脊髓(C8-T2)外側(cè)角等部位的表達(dá)均增高,推測電針治療促使自主神經(jīng)中樞SP合成與釋放以及NOS活性增強(qiáng)。脊髓外側(cè)角SP含量增加進(jìn)而促進(jìn)交感神經(jīng)元放電增加,抑制迷走神經(jīng)放電頻率降低,總的效應(yīng)促使心率加快,房室交界的傳導(dǎo)加快,心房肌和心室肌的收縮能力加強(qiáng),改善心肌缺血;NOS活性增強(qiáng),催化NO生成,NO具有高度的脂溶性,極易通過細(xì)胞膜迅速通過血腦屏障,直接作用于外周血管平滑肌而發(fā)揮舒張心血管,同樣達(dá)到改善心肌供血效應(yīng),這與某些藥物提高心肌缺血時(shí)NOS水平抗心肌損傷療效相似。有研究發(fā)現(xiàn),SP可通過增強(qiáng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型NOS的表達(dá)來促進(jìn)NO的分泌。對于本實(shí)驗(yàn)中SP與NOS之間具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。見表1。說明:造模前、造模后0、5、10、20min與A組3、8、13