電針內(nèi)關穴抗心肌缺血作用的實驗研究

電針內(nèi)關穴抗心肌缺血作用的實驗研究

內(nèi)關穴是治療心血管疾病的重要穴之一。大量的臨床和實驗研究證明,針刺內(nèi)關具有顯著的抗心肌缺血損傷作用,且該作用具有明顯的相關特異性。下丘腦室旁核(paraventricularnucleus,PVN)是下丘腦前區(qū)最重要的核團之一,既參與自主神經(jīng)調(diào)節(jié),又參與神經(jīng)內(nèi)分泌控制,與下丘腦、腦干、脊髓等中樞自主神經(jīng)核團間存在廣泛的纖維聯(lián)系,是心血管系統(tǒng)活動調(diào)節(jié)的重要核團。研究顯示,PVN內(nèi)存在豐富的內(nèi)阿片肽能神經(jīng)元、神經(jīng)末梢及阿片受體,對心血管功能發(fā)揮重要的緊張性抑制作用。本實驗在前期研究證明電針“內(nèi)關”對急性心肌缺血有保護作用的基礎上,進一步觀察PVN內(nèi)微量注射阿片受體拮抗劑納絡酮對電針“內(nèi)關”穴抗心肌缺血損傷作用的影響,探討電針“內(nèi)關”抗心肌缺血損傷的作用機制。1材料和方法1.1實驗家兔1.2清潔級日本大耳白兔40只(華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供,批號:19-025),在湖北中醫(yī)學院實驗動物中心飼養(yǎng),室溫25℃。體重1.8~2.3kg,雌雄不限。將實驗家兔按隨機數(shù)字表法分為模型對照組(10只):PVN人工腦脊液注射60min后行心肌缺血造模,不治療;納絡酮對照組(10只):PVN納絡酮微量注射60min后行心肌缺血造模,不治療;電針加腦脊液組(10只):PVN人工腦脊液注射60min后行心肌缺血造模,隨即電針“內(nèi)關”穴;電針加納絡酮組(10只):PVN納絡酮微量注射60min后行心肌缺血造模,隨即電針“內(nèi)關”穴。各組動物處理按照下述實驗方法進行。1.2實驗方法(1)pvn微量注射實驗家兔用20%烏拉坦(800mg/kg)行耳緣靜脈注射麻醉后,俯臥固定在腦立體定位儀上(WDT-Ⅱ型,國營西北光學儀器廠生產(chǎn)),顱頂備皮,剪開皮膚,用3%雙氧水涂擦,暴露顱骨,確定前囟中點、人字縫,使人字縫尖端低于前囟1.5mm。按Sawyer氏兔腦圖譜,以前囟中點為坐標零點時PVN坐標為AP:0mm,L(R):±0.5mm,H:-13.5mm,前囟不規(guī)則兔按金觀源等方法進行坐標修正,定位PVN。用牙科電鉆行顱骨開孔,將微量注射器固定在腦立體定位儀的專用電極操縱控制器上,按上述坐標以先左后右順序分別進行兩側(cè)PVN微量注射。每側(cè)PVN注射納絡酮1μL(人工腦脊液稀釋,2μg/μL)或人工腦脊液1μL(注射用時2min,留針10min)。注射結(jié)束后骨蠟封口。(2)相互分離左心PVN內(nèi)微量注射結(jié)束后60min進行急性心肌缺血造模。將實驗家兔仰臥固定于兔臺上,胸前壁備皮并鋪消毒孔巾,從胸骨柄稍下方至胸骨劍突上方約2cm處,做正中皮膚切口,沿胸骨左緣分離胸壁肌肉,并剪斷左側(cè)第3、4肋軟骨(注意緊貼胸骨左緣開胸,以免傷及左側(cè)內(nèi)乳動脈和造成氣胸)。然后用開胸器暴露心臟,剪開心包,暴露左心耳及大部分左心室,再在左心耳下緣仔細尋找冠狀動脈前降支,并于左室壁上、中1/3交界處,以細圓針引絲線結(jié)扎,阻斷冠狀動脈血流。模型成功的標志:收緊結(jié)扎線后,左室前壁發(fā)紺向外膨脹及Ⅱ?qū)?lián)心電圖S-T段抬高、T波高聳。(3)電針治療內(nèi)關在結(jié)扎冠狀動脈左前降支(leftanteriordescending,LAD)后,立即記錄心電圖及左心室心肌細胞跨膜電位,記錄完畢后,對電針加腦脊液組、電針加納絡酮組進行電針治療。按照中國針灸學會實驗針灸研究會1992年制訂的《實驗動物穴位定位標準》,取“內(nèi)關”穴(前臂下1/6折點處外側(cè),橈、尺骨縫中)。用G6805-Ⅱ型電針治療儀對雙側(cè)“內(nèi)關”穴進行電針刺激,通電30min,電針參數(shù):選用連續(xù)波、振幅1.2V、頻率7Hz、強度0.6mA。(4)心電記錄及主被動在PVN注射前后、心肌缺血造模前后不同時間段分別進行心電圖記錄。動物麻醉后靜置15min,記錄心電圖(Ⅱ?qū)?lián))作為基礎對照。隨后于PVN注射完畢即刻,注射后15min、30min、45min、60min,冠狀動脈前降支結(jié)扎即刻(電針“內(nèi)關”穴前),電針后15min、30min、45min、60min各時間點記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖1次。每次記錄1min,心電記錄紙速25mm/s,波幅1mV。測量10個心動周期的ST段電位,計算其平均值。(5)材料制備和測量記錄時間:分別在冠脈結(jié)扎前(暴露心臟后),冠脈結(jié)扎后即刻(心電圖記錄后,電針“內(nèi)關”穴前),電針后15min、30min、45min、60min記錄左心室肌細胞跨膜電位,每次記錄5min。記錄方法:采用全自動拉制儀(P-83電極拉制器,Narishige,日本)進行玻璃微電極拉制。顯微鏡下檢查電極形狀及尖端開口,尖端外徑應小于0.5μm。實驗前充灌入3mol/LKCl溶液,測電阻在10~30MΩ之間為理想玻璃微電極。實驗時,將自制懸浮螺旋狀銀絲固定于微電極操縱器上,尾端與微電極放大器(JL-H2003,上海嘉龍教學儀器廠)輸入端相連,銀絲頭端插入玻璃微電極尾端的溶液中(玻璃微電極固定在銀絲頭端)。測量時,暴露心臟,調(diào)節(jié)微電極操縱器,將微電極尖端插入左心室肌心尖部(結(jié)扎點下4~5mm,前室間溝左側(cè)2~3mm),引導左心室前壁單個心室肌細胞跨膜電位,引導信號經(jīng)微電極放大器輸入到四道生理記錄儀(RM-6200型,成都儀器廠生產(chǎn))。分析:靜息電位(RP)、動作電位振幅(actionpotentialamplitude,APA)、動作電位復極50%、90%時所需時間(actionpotentialdurations,APD50、APD90)。分析動作電位按下列標準選擇:①基線平穩(wěn);②造模前記錄中APA不小于100mV,RP絕對值不小于70mV;③可穩(wěn)定記錄動作電位5min以上;④除動作電位上升支起始部偶有偽跡外,其他部位無任何偽跡;⑤取連續(xù)10個動作電位的均值計算各參數(shù)。(6)心肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化心電圖及心肌細胞跨膜電位記錄結(jié)束后,家兔斷頭處死。取左心室前壁距心尖部0.5~1cm處心肌組織,2.5%戊二醛鋨酸固定液固定,常規(guī)EPON812包埋,超薄切片,醋酸鈾-枸緣酸鉛染色,透射電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化。取腦,10%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,組織學觀察PVN注射點情況。(7)單因素方差分析實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示,采用SPSS10.0軟件包進行單因素方差分析(one-wayANOVA),方差齊者組間比較用SNK(Student-Newman-Keuls)檢驗,方差不齊者用Games-Howell檢驗。2結(jié)果2.1pvn注射成功情況用于PVN微量注射家兔共53只。其中28只注射人工腦脊液,25只注射納絡酮。各有20只(共計40只)注射點位于雙側(cè)PVN內(nèi),視為PVN注射成功(見圖1)。實驗數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計學處理。另有13只家兔或僅單側(cè)PVN內(nèi)存在注射點,或雙側(cè)注射點偏差較大,視為PVN注射失敗,實驗數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計學處理。注射點中心位于PVN內(nèi)的40只家兔(共計80個注射點),其注射點位于內(nèi)側(cè)小細胞部者有32個,位于外側(cè)大細胞部者有28個,位置偏淺位于背側(cè)小帽下方有5個,另有15個注射點位置稍深,介于內(nèi)側(cè)小細胞部和外側(cè)大細胞部之間的下部。2.2對pvn注射點超微結(jié)構(gòu)的影響電鏡下觀察,各組心肌細胞均呈現(xiàn)不同程度的1.PVN外側(cè)大細胞部;2.PVN內(nèi)側(cè)小細胞部;3.PVN腹側(cè)部;4.PVN背側(cè)小帽;5.視束;6.視上聯(lián)合;7.下丘腦外側(cè)區(qū);8.未定帶;9.連結(jié)核;10.示一側(cè)PVN注射點分布范圍缺血性改變,主要表現(xiàn)為:心肌細胞腫脹,肌原纖維排列紊亂,肌原纖維斷裂并可見閏盤處變性;線粒體明顯腫脹,峭斷裂;血管內(nèi)皮細胞腫脹嚴重,吞飲小泡明顯減少,電子密度不均勻,部分內(nèi)皮細胞核與胞體分離等。模型對照組和納絡酮對照組心肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化較為典型,差異不明顯;電針加腦脊液組缺血區(qū)心肌細胞腫脹較輕,肌原纖維排列整齊,肌絲清晰,基本無斷裂,線粒體腫脹較輕,未見線粒體峭斷裂情況,血管內(nèi)皮細胞輕度腫脹,吞飲小泡豐富;電針加納絡酮組損傷情況介于電針加腦脊液組與模型對照組、納絡酮對照組之間。2.3納絡酮微量注射對正常家兔心肌功能的影響各時間段各組家兔Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段電位變化見表1。表1示PVN微量注射前后(心肌缺血造模前)各組ST電位組間及組內(nèi)比較差異無顯著性意義(P>0.05);冠脈結(jié)扎后各組各時間段ST段電位較結(jié)扎前顯著升高,其中以電針后15min變化最為顯著;冠脈結(jié)扎后即刻4組間差異無顯著性意義(P>0.05);電針后15min、30min及45min3個時間段納絡酮對照組與模型對照組比較差異無顯著性意義(P>0.05),電針后60min納絡酮對照組ST段電位值較模型對照組低(P<0.05);電針后15~60min4個時間段電針加腦脊液組和電針加納絡酮組ST段電位值均顯著低于模型對照組和納絡酮對照組(P<0.05),且電針加腦脊液組顯著低于電針加納絡酮組(P<0.05)。以上結(jié)果提示PVN納絡酮微量注射對正常家兔心肌功能無影響,對缺血心肌功能影響輕微,在結(jié)扎(缺血)60min時發(fā)揮一定的保護作用;電針“內(nèi)關”穴對缺血心肌有明顯的保護作用,該作用可被PVN注射納絡酮所削弱,但不能完全阻斷。2.4paa、apd各時間段各組心肌細胞APA、APD50、APD90變化見表2~表4。各組冠狀動脈結(jié)扎電針后與結(jié)扎前比較,APA、APD50、APD90值均發(fā)生顯著變化(P<0.05);與模型對照組比較,納絡酮對照組各時間段APA、APD值大多升高,其中電針后60min納絡酮對照組APA值顯著高于模型對照組(P<0.05);電針加腦脊液組與其他各組比較,電針后15~60min4個時間段APA、APD值均顯著高于其他各組(P<0.05);各時間段,電針加納絡酮組與模型對照組、納絡酮對照組比較無顯著差異(P>0.05),與電針加腦脊液組比較,在電針后各時間段有顯著差異(P<0.05)。以上結(jié)果提示缺血對心肌細胞APA、APD50、APD90存在顯著影響;PVN納絡酮注射對缺血心肌細胞跨膜電位及復極時間具有一定影響;電針“內(nèi)關”穴對缺血心肌具有明顯保護作用,該作用可被PVN納絡酮微量注射明顯削弱。3pvn及其內(nèi)阿片肽對電針“內(nèi)關”穴抗心肌缺血效應的作用納絡酮(Naloxone,NLX)為17-烯丙基-4,5a-環(huán)氧基-3,14-二羥基嗎啡喃-6-酮,是特異性的阿片受體拮抗劑,對三種阿片受體亞型μ、κ、δ均有拮抗作用。多年來作為工具藥而廣泛應用,近年也有一些用于針刺信息的中樞通路及針刺效應中樞機制的研究,但尚未見應用于探討PVN內(nèi)阿片肽在電針“內(nèi)關”穴抗心肌缺血損傷中的作用的研究報道。PVN位于第三腦室下丘腦部的上端兩側(cè),呈長楔形輪廓,是下丘腦前區(qū)最顯著的核團之一,在心血管系統(tǒng)活動及神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。PVN存在有大量肽能神經(jīng)纖維、肽能神經(jīng)元及豐富的阿片受體(μ、κ、δ亞型),與下丘腦、腦干、脊髓等中樞自主神經(jīng)核團間存在廣泛的纖維聯(lián)系。一般認為,中樞內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)是一個潛在的心血管調(diào)節(jié)系統(tǒng),內(nèi)阿片肽在PVN中起著重要的緊張性抑制作用。本實驗發(fā)現(xiàn),電針“內(nèi)關”穴對心肌缺血具有明顯的保護作用,該作用可被PVN微量注射納絡酮所削弱但不能完全阻斷