促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子mab和pab的多克隆抗體的制備及鑒定

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子mab和pab的多克隆抗體的制備及鑒定

促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)釋放因子（crf）是一個含有41個氨基酸殘基的矩陣，主要由囊動動物大腦中的小細(xì)胞組成。CRF與一些激素的分泌調(diào)節(jié)及多種生理反應(yīng)有關(guān),應(yīng)激引起的血漿ACTH及糖皮質(zhì)激素升高依賴于CRF的釋放。睡眠剝奪(sleepdeprivation,SD)是指由于各種原因引起的睡眠丟失狀態(tài),并引起情緒、學(xué)習(xí)記憶、免疫功能等一系列改變,是機(jī)體一種急性應(yīng)激反應(yīng),但其腦內(nèi)機(jī)制還不完全清楚。本研究中,我們首先成功地制備了抗CRF的單克隆抗體(mAb)和多克隆抗體(pAb),初步鑒定確認(rèn)其中2株mAb和pAb可用于免疫組化染色。在此基礎(chǔ)上用其觀察睡眠剝奪48h大鼠腦內(nèi)CRF的變化,旨在為了解調(diào)節(jié)睡眠剝奪應(yīng)激反應(yīng)的腦環(huán)路提供神經(jīng)形態(tài)學(xué)資料。1材料和方法1.1蛋白和細(xì)胞的制備CRF抗原購自AmericanPeptide公司;牛甲狀腺球蛋白(bovinethroglobulin,BTG)和碳二亞胺均為Sigma公司產(chǎn)品;牛血清的蛋白(BSA)為國產(chǎn)分析純級制品,購自華美公司;生物素化兔二抗、鼠二抗及ABC復(fù)合物購自美國Vector公司;Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞為本室保存;聚乙二醇(Mr4000)為德國MERK公司產(chǎn)品;超級新生小牛血清為杭州四季青生物技術(shù)公司產(chǎn)品;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板及酶標(biāo)板為丹麥NUNC公司產(chǎn)品;新西蘭大白兔、Sprague-Dawley大鼠和BALB/c小鼠,均由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。1.2方法1.2.1雜交瘤細(xì)胞的制備①免疫抗原和包被抗原的交聯(lián):選擇BTG和BSA作為載體蛋白,采用碳二亞胺二步法和戊二醛二步法分別與CRF交聯(lián),制備免疫抗原BTG-CRF和檢測用包被抗原BSA-CRF。②抗CRFpAb的制備:選取健康雄性新西蘭種大白兔3只,體質(zhì)量2.5kg左右,背部皮下多點(8～12點)和兩側(cè)腹股溝皮下單點注射抗原進(jìn)行免疫。間隔3wk免疫1次,共免疫4次。首次免疫時,每只兔子用200μgBTG-CRF,溶解于1mL生理鹽水,與等體積弗氏完全佐劑混合,乳化后立即使用;以后每次用量均為100μg,溶解于1mL生理鹽水,與等體積不完全弗氏佐劑混合乳化后使用。③抗CRFmAb的制備:將交聯(lián)蛋白BTG-CRF與完全福氏佐劑等體積混合乳化后,對每只BALB/c小鼠(雌性,6～8wk齡)皮下注射20μg(0.5mL/只)免疫,隨后每隔15d以不完全福氏佐劑乳化的BTG-CRF,共免疫4次。末次免疫后,再予腹腔注射20μg(0.5mL/只),3d后取脾進(jìn)行融合。雜交瘤細(xì)胞的制備按常規(guī)方法進(jìn)行。篩選時,以檢測抗原BSA-CRF包被ELISA板,篩選抗CRF的mAb細(xì)胞株,并測定其效價。1.2.2免疫組化crf①效價檢測:新西蘭家兔從第3次免疫后開始,每次免疫7～10d后從耳靜脈采血,分離血清,用ELISA測定抗體效價。其步驟是將可溶性BSA-CRF抗原(1mg/L)包被于ELISA板,免疫兔血清按10倍梯度稀釋成不同濃度作為一抗,并設(shè)立抗體稀釋液的空白對照,孵育過夜。二抗為酶標(biāo)記抗兔IgG(1∶4000,博士德公司),在37℃孵育1h。用ABTS作為底物,加入適量過氧化氫呈色。30min內(nèi)觀察反應(yīng)孔內(nèi)顏色判定結(jié)果。陽性反應(yīng)呈藍(lán)色,陰性反應(yīng)為無色或極淡藍(lán)色。自首次免疫4次后從兔頸動脈放血,分離血清,-20℃凍存待用。BALB/c小鼠從第3次免疫后從鼠尾取血,用同樣方法按10倍梯度檢測其效價。②交叉反應(yīng)試驗:將BSA-CRF按2mg/L包被于ELISA板上,4℃過夜,將5種類似物小肽AVP,[Lys8]-Vasopressin,[Asu1,6.Arg]-Vasotocin,Oxytocin和[Arg8]-Vasotocin.,抑制反應(yīng)起始量為1μg,進(jìn)行倍比稀釋,分別與CRFpAb及mAb混合,37℃30min,洗滌后分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體或羊抗鼠抗體孵育,洗滌后顯色。③mAb的Ig亞類與亞型:采用Sigma公司試劑盒的說明書進(jìn)行鑒定。④秋水仙堿腦內(nèi)注射進(jìn)行免疫組化鑒定:2只SD大鼠側(cè)腦室注射秋水仙堿(2g/L)6μL,約在12～24h大鼠出現(xiàn)尿失禁后立即常規(guī)灌注處死,取腦,切片,進(jìn)行CRF免疫組織化學(xué)染色。其方法如下所述。1.2.3大鼠睡眠剝奪心理應(yīng)激的小平臺水環(huán)境法選健康、雄性Sprague-Dawley大鼠,體質(zhì)量為(170±5)g。將動物隨機(jī)分成3組:小平臺組、大平臺組及正常組,每組3只。實驗前,使其在未注水的實驗環(huán)境中(下述)充分適應(yīng)1wk,以排除或減弱環(huán)境造成的心理應(yīng)激。采用小平臺水環(huán)境法建立大鼠睡眠剝奪模型。用本校航空心理學(xué)教研室根據(jù)文獻(xiàn)制造的體積為(30.0×30.0×30.0)cm3的鼠箱。平臺高8.0cm,小平臺的面積為(6.3×6.3)cm2,大平臺的面積為(18×18)cm2。在平臺周圍注滿水,水溫保持在20℃左右。水面距平臺面約1.0cm。鼠在平臺上可自行飲食、飲水。小平臺上的大鼠若睡眠,則會由于肌肉張力松弛而跌落入水中,故置于小平臺上的大鼠不會睡眠,處于睡眠剝奪狀態(tài)。室內(nèi)溫度控制在18℃～22℃,持續(xù)以40W日光燈照射。實驗時,大平臺和小平臺的大鼠放置在平臺上連續(xù)48h。1.2.4免疫組化試驗大鼠用10g/L戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉后開胸,經(jīng)心灌流,先用100mL生理鹽水快速灌注沖洗血液,然后用預(yù)冷的40g/L多聚甲醛固定液400mL灌流。待固定液滴注完畢,取出全腦,用40g/L多聚甲醛后固定2h,再放入200g/L蔗糖溶液4℃過夜。組織塊完全沉底后,用冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,每5張切片中取1張,腦切片的厚度為50μm。先將所有切片經(jīng)0.01mol/LPBS漂洗5min×3次后,浸入800mL/L甲醇和3mL/LH2O2封閉30min,PBS漂洗,再用10mg/LBSA、30mL/L羊血清和3mL/LTritonX-100封閉1h,用ABC方法進(jìn)行免疫組化染色。兔或鼠的CRF免疫抗血清(1∶3000～10000)作為一抗,孵育切片,室溫下36h,0.01mol/LPBS漂洗10min×3次;生物素化的羊抗兔IgG(1∶500)或羊抗小鼠IgG(1∶500)室溫孵育切片4h,PBS漂洗;生物素-卵白素-辣根過氧化物酶復(fù)合物(ABC,1∶500)室溫孵育切片2h,PBS漂洗;硫酸鎳胺加強DAB蘭色反應(yīng)呈色。當(dāng)陽性產(chǎn)物呈深蘭色而背底幾乎無色時終止反應(yīng)。經(jīng)脫水、透明和封片后,OlympusBH-2顯微鏡(×20)鏡檢。部分切片用做免疫組化方法對照試驗,一抗用BSA稀釋液替代;二抗、ABC復(fù)合物同其他免疫組化反應(yīng)切片,結(jié)果未見陽性表達(dá)。1.2.5統(tǒng)計處理在各組動物對腦內(nèi)CRF表達(dá)較多的4個腦區(qū)進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù),用非參數(shù)秩和檢驗進(jìn)行顯著性差異分析,以P<0.05為顯著性差異。2結(jié)果2.1elisa測定兔crf血清滴度的測定所用CRF抗原是交聯(lián)蛋白,分別用BTG-CRF作為免疫原,BSA-CRF作為檢測原,在免疫3次后,ELISA檢測兔抗CRF血清滴度為1∶10000時,A值在1以上,而單獨用BTG或BSA作為包被抗原的孔中卻無著色,在免疫4次后,ELISA檢測兔抗CRF血清滴度為1∶100000,遂從兔頸動脈放血,分離到免疫血清約20mL。2.2凍存穩(wěn)定性測定融合前血清中抗體的效價達(dá)1∶105,細(xì)胞融合率100%,得到可穩(wěn)定分泌CRFmAb的雜交瘤細(xì)胞9株。將其連續(xù)培養(yǎng)并反復(fù)凍存后,仍能穩(wěn)定分泌mAb。Ig亞類均為IgG2a,亞型為κ型,腹水效價達(dá)到1∶108。經(jīng)免疫組化染色證實,有2株(1D10,2F4)可用于免疫組織化學(xué)染色,在注射秋水仙堿的大鼠腦片的下丘腦室旁核(paraverticularhypothalamicnucleus,PVN)小細(xì)胞部中染出大量陽性細(xì)胞。2.3抗k的特異性交叉反應(yīng)結(jié)果表明我們制備的CRFpAb、mAb與5種存在于下丘腦室旁核的其他神經(jīng)肽及其擬似小蛋白均無交叉反應(yīng)。2.4大鼠腦片中表達(dá)情況與正常組相比,睡眠剝奪組的大鼠身體細(xì)瘦,皮毛蓬亂,極度敏感,易激惹。當(dāng)輕觸它時,經(jīng)常向后退,尖叫,跳躍。用制備的CRFpAb或mAb進(jìn)行染色,在正常組腦內(nèi)未見到明顯的CRF樣免疫反應(yīng)產(chǎn)物。在睡眠剝奪48h,大鼠腦切片上觀察到,下丘腦室旁核(PVN)、杏仁核中央亞核(centralsubnucleusofAmygdala,Ace)、終紋床核的卵圓亞核(ovalsubnucleusofbednucleusofstriaterminalis,BNSTov)、孤束核(nucleusofsolitarytract,NTS)均有強烈的陽性表達(dá),部分大腦皮質(zhì)(cerebralcortex)神經(jīng)元中亦有陽性表達(dá)(圖1)。陽性細(xì)胞以雙極或梭形細(xì)胞為主,亦可見多極細(xì)胞,胞質(zhì)內(nèi)陽性反應(yīng)產(chǎn)物較淡,分布均勻,纖維細(xì)長深染,胞核未見染色。大平臺對照組在對應(yīng)核團(tuán)中亦有陽性細(xì)胞,但數(shù)量較睡眠剝奪組明顯地減少(表1)。2.5大平臺組和正常組睡眠剝奪大鼠睡眠剝奪大鼠一般情況采用SPSS軟件的非參數(shù)秩和檢驗(nonparametrictestofranktransformation),結(jié)果顯示睡眠剝奪組與對照組和正常組差異顯著(P<0.05),而大平臺組與正常組無顯著差異。3大鼠睡眠剝奪應(yīng)激時腦內(nèi)crf的合成目前市售的CRF抗體用于免疫組化染色效果不佳,陽性結(jié)果弱,且背底深。為了更好的進(jìn)行研究,我們首先成功地制備了符合實驗要求的CRF的pAb和mAb,而且所用的免疫抗原和檢測抗原是不同的交聯(lián)蛋白,遂使有較高的免疫原性,蛋白易于純化。4次免疫后就檢測到較高效價的穩(wěn)定分泌的pAb,并用所獲得的抗體在秋水仙素腦室內(nèi)預(yù)處理的大鼠進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。由于秋水仙素阻斷軸漿流,使胞體部位合成的肽類物質(zhì)積聚,局部濃度升高而易于免疫組織化學(xué)染色。我們用所制備的pAb和2株mAb在實驗組染出的陽性產(chǎn)物分布部位,與文獻(xiàn)報道的結(jié)果完全一致,證明所獲得抗體的特異性。正常腦組織神經(jīng)元中的CRF含量低,用免疫組織化學(xué)方法無法檢出。對于動物,睡眠剝奪48h是一個極強的應(yīng)激刺激。本實驗中的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在下丘腦室旁核、杏仁核中央亞核、終紋床核卵圓亞核、孤束核、大腦皮質(zhì)等處神經(jīng)元胞體及其突起內(nèi)均出現(xiàn)強或較強的CRF陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物,與對照組呈現(xiàn)顯著性差異。這個結(jié)果提示在大鼠睡眠剝奪應(yīng)激時腦內(nèi)合成大量的CRF以適應(yīng)應(yīng)激的需要。下丘腦室旁核是下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的起始部位,是腦內(nèi)調(diào)節(jié)自主神經(jīng)和神經(jīng)內(nèi)分泌的整合中樞,傳入和傳出纖維聯(lián)系廣泛。終紋床核卵圓亞核是下丘腦室旁核主要的非下丘腦來源的前腦直接傳入聯(lián)系核團(tuán),也是杏仁核中央亞核、內(nèi)側(cè)前額皮質(zhì)和外側(cè)隔區(qū)等下丘腦室旁核間接傳入腦區(qū)的中繼核團(tuán)。杏仁核中央亞核與行為、自主神經(jīng)活動和內(nèi)分泌功能的調(diào)控有關(guān),通過終紋床核的換元或通過其與腦干的聯(lián)系而間接支配下丘腦室旁核。許多研究已經(jīng)證明,杏仁核中央亞核-終紋床核-下丘腦室旁