溫度刺激對去卵巢大鼠下丘腦視上核和室旁核c-fos蛋白表達(dá)的影響

溫度刺激對去卵巢大鼠下丘腦視上核和室旁核c-fos蛋白表達(dá)的影響

溫度刺激會導(dǎo)致一系列持續(xù)和不可加熱動物的生理和行為變化。外界環(huán)境溫度變化可引起恒溫動物體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)和滲透壓變化等一系列的特殊協(xié)調(diào)反應(yīng)。下丘腦視上核(supraopticnucleus,SO)和室旁核(theparaventricularnuclei,PVN)參與溫度調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)及一系列協(xié)調(diào)反應(yīng),與動物的渴覺感受及水鹽平衡代謝密切相關(guān)。SO和PVN內(nèi)含有多種神經(jīng)活性物質(zhì),如加壓素(VP)和縮宮素(OT)。其中,SO以加壓素能神經(jīng)元為主,而PVN以O(shè)T能神經(jīng)元為主。SO和PVN分泌的VP和OT通過下丘腦垂體束進(jìn)入垂體后葉,釋放入血發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。當(dāng)動物進(jìn)食高鹽食物、血鈉濃度和血漿滲透壓增高時,SO和PVN中與VP分泌有關(guān)的神經(jīng)元就會被激活,神經(jīng)內(nèi)分泌增強(qiáng),血液中VP濃度上升。FOS蛋白作為神經(jīng)元活動狀態(tài)的標(biāo)記物,已被廣泛接受并且作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性神經(jīng)激活的神經(jīng)元形態(tài)標(biāo)記物,是與神經(jīng)元激活密切相關(guān)的核蛋白,已成為定位因急性溫度改變而激活的神經(jīng)元細(xì)胞和細(xì)胞群的重要方法。因此,通過免疫組化方法檢測c-Fos蛋白的表達(dá),可確定細(xì)胞的活躍情況。激素缺乏和溫度改變與SO和PVN神經(jīng)元相應(yīng)變化的內(nèi)在聯(lián)系業(yè)已得到證實(shí),這將推進(jìn)更年期癥狀機(jī)制的研究。本研究擬根據(jù)四季溫度的變化,選取4,10,25,33和38℃5個等級的環(huán)境溫度,應(yīng)用cFos免疫組化方法觀察去卵巢大鼠下丘腦SO和PVN神經(jīng)元對不同溫度刺激產(chǎn)生的反應(yīng),顯示核團(tuán)的溫度敏感范圍和細(xì)胞活躍程度,并推測其是否影響下丘腦的溫度調(diào)節(jié)及其他系統(tǒng)的功能。材料和方法一、材料表面1.實(shí)驗(yàn)動物2.主要試劑及儀器二、方法1.去卵巢大鼠模型的建立2.實(shí)驗(yàn)分組處理3.切片制備和免疫組化染色4.數(shù)據(jù)采集三、表達(dá)c-fos蛋白表達(dá)細(xì)胞密度和表達(dá)溫度的關(guān)系數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果。對SO和PVN的c-Fos蛋白表達(dá)細(xì)胞計數(shù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);對OVX組和Sham組表達(dá)c-Fos蛋白陽性細(xì)胞密度在不同溫度下相互比較采用單因素方差分析;對溫度和手術(shù)2種處理因素以及有無交互作用采用雙因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。大鼠體質(zhì)量變化80只實(shí)驗(yàn)動物除1只因麻醉過量死亡外,其余都存活,狀態(tài)良好。OVX組與Sham組相比,術(shù)后1～2d體質(zhì)量稍減小(P<0.05),術(shù)后第3天開始恢復(fù)。隨后大鼠的飲食量明顯增加,體質(zhì)量增加較快,1周左右達(dá)到術(shù)前體質(zhì)量,術(shù)后2周體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)。溫度刺激前,安靜環(huán)境下飼養(yǎng),自由飲食,切口無紅腫,愈合良好。一、大鼠臟器規(guī)劃Sham組每只大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片成分不盡相同,但大多為胞質(zhì)薄、透明藍(lán)染的表層多角形細(xì)胞,呈動情周期性變化;OVX組大鼠動情周期性變化消失,陰道細(xì)胞呈持續(xù)的動情間期表現(xiàn),細(xì)胞涂片成分較單一,細(xì)胞小而圓,主要為核大而圓、胞質(zhì)藍(lán)染的外底層細(xì)胞。根據(jù)陰道脫落細(xì)胞形態(tài)判斷去卵巢手術(shù)是否成功。二、不同溫度對讓函數(shù)的影響棕褐色的Fos免疫陽性物質(zhì)主要位于下丘腦神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)。1.同組在不同溫度刺激下,下丘腦SO中c-Fos蛋白陽性細(xì)胞密度的變化2.同組不同溫度刺激下,下丘腦PVNc-Fos蛋白陽性細(xì)胞密度的變化so和pvn表達(dá)的多態(tài)性和復(fù)配的能力SO和PVN是下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamuspituitary-adrenalaxis,HPA)的組成部分及直接控制部位,是整合運(yùn)動應(yīng)激反應(yīng)的活化中樞。SO和PVN是下丘腦中兩個與血壓、滲透壓感受、加壓素分泌以及水平衡調(diào)節(jié)密切相關(guān)的核團(tuán)。一旦異常會直接影響到上述正常的生理功能,這或許是更年期婦女各個系統(tǒng)都易于出現(xiàn)不適癥狀,乃至疾病的原因之一。因此,研究這兩個核團(tuán)的功能調(diào)節(jié)具有重要的意義。另外,PVN還參與血管活動的調(diào)節(jié),是維持心血管穩(wěn)定的一個重要調(diào)控系統(tǒng)。本研究所觀察到的不同溫度刺激Sham組SO和PVN核團(tuán)c-Fos蛋白表達(dá)與Bratincsák等和Harikai等的研究結(jié)果相似,隨著溫度刺激強(qiáng)度增強(qiáng),核團(tuán)細(xì)胞反應(yīng)活躍且細(xì)胞活躍曲線呈現(xiàn)“∨”字型,且熱刺激對核團(tuán)細(xì)胞的影響比冷刺激更加明顯。本研究發(fā)現(xiàn),同一溫度刺激下OVX組SO和PVN中c-Fos蛋白表達(dá)的細(xì)胞密度與Sham組不同,推測OVX組體溫調(diào)節(jié)以及內(nèi)分泌功能狀態(tài)發(fā)生了變化。根據(jù)不同溫度刺激下,相鄰溫度之間Sham組和OVX組SO和PVN表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)、弱陽性的細(xì)胞密度有差異,推測表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞對外界溫度刺激的敏感范圍:Sham組SO和PVN的敏感范圍為低于4℃或高于38℃;OVX組SO的敏感范圍為10℃～33℃,PVN的敏感范圍為25℃～33℃。推測表達(dá)c-Fos蛋白弱陽性細(xì)胞對外界溫度刺激的敏感范圍:Sham組SO的敏感范圍為25℃～33℃,PVN的敏感范圍為4℃～10℃和25℃～38℃;OVX組SO的敏感范圍分別為4℃～10℃和33℃～38℃,PVN的敏感范圍為33℃～38℃。由上述結(jié)果可見,卵巢切除后性激素減少,OVX組SO表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞和PVN表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)、弱陽性細(xì)胞對外界溫度刺激可能的敏感范圍均較Sham組變窄,PVN敏感范圍縮小更為明顯,提示性激素缺乏時,因外界溫度變化而引發(fā)的中樞神經(jīng)元功能狀態(tài)變化有別于性激素正常者,且能夠隨著外界溫度變化而進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)節(jié)的范圍變窄,而OVX組SO表達(dá)c-Fos蛋白弱陽性細(xì)胞對溫度敏感范圍稍大,筆者推測這可能是一種代償機(jī)制。OVX組SO和PVN表達(dá)c-Fos蛋白陽性細(xì)胞密度降低,也提示在性激素缺乏時中樞神經(jīng)功能狀態(tài)發(fā)生了異常改變。綜上,筆者認(rèn)為下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞溫度調(diào)定點(diǎn)因缺乏性激素而發(fā)生改變,導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱和散熱的平衡失協(xié)調(diào),引發(fā)更年期體溫異常波動,發(fā)生潮熱、出汗等癥狀。除此之外,SO和PVN表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞交互作用明顯,提示手術(shù)去勢因素和環(huán)境溫度因素共同影響其體溫調(diào)節(jié)能力。體液的平衡需要精氨酸加壓素(argininevasopressin,AVP)來維持。SO神經(jīng)元的激活導(dǎo)致AVP的合成,其釋放入血會引起水鈉潴留。最近的研究表明,脫水大鼠糖皮質(zhì)激素較少是由于SO和PVN大細(xì)胞神經(jīng)元活性降低以及分泌的VP減少。腹腔內(nèi)注射高滲氯化鈉引起急性血漿滲透壓增高由大腦的滲透壓感受器感受刺激后,興奮SO和PVN內(nèi)的大細(xì)胞釋放VP入血。同時大細(xì)胞內(nèi)c-fos和vp基因的表達(dá)增加。有害的刺激會導(dǎo)致c-fosmRNA的表達(dá)且增加大細(xì)胞神經(jīng)元內(nèi)avp基因的表達(dá)。滲透壓刺激會導(dǎo)致SO內(nèi)的FOS家族成員的表達(dá)。SO神經(jīng)元接受去甲神經(jīng)纖維支配而活躍并刺激VP和OT的釋放,尤其是在血壓和血容量的調(diào)節(jié)過程中。雌二醇可以調(diào)節(jié)avp基因的表達(dá)以及調(diào)節(jié)大細(xì)胞分泌AVP。此外,AVP神經(jīng)元的激活可能是通過表達(dá)雌激素受體α(ERα)的傳入神經(jīng)元。雌激素水平降低時,由于SO和PVN活躍細(xì)胞密度的減少,導(dǎo)致其分泌VP功能也受到影響,這也許是圍絕經(jīng)期婦女血壓不穩(wěn)、胸悶、頭暈?zāi)垦：托募碌刃难馨Y狀的原因。絕經(jīng)后女性高血壓患病率與男性相當(dāng),甚至高于男性,可能也與SO和PVN活躍細(xì)胞密度減少甚至消失及分泌VP功能障礙有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),更年期大鼠與正常大鼠SO和PVN中c-Fos蛋白的表達(dá)有差異。這可能是引起更年期婦女情緒煩躁、胸悶、心悸、學(xué)習(xí)記憶力下降、感覺異常、呼吸急促、消化功能異常、能量代謝以及糖類和脂類代謝異常等常見問題的原因,故有必要對其進(jìn)一步深入研究,闡述更年期體溫調(diào)節(jié)異常以及其他癥狀的發(fā)生機(jī)制,為選擇最佳的治療方式提供理論依據(jù)。健康成年清潔級雌性Spraque-Dawley(SD)大鼠80只,購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證:SCXK(京2006-0008),實(shí)驗(yàn)動物使用許可證:SYXK(京2006-0025),體質(zhì)量210～230g,飼養(yǎng)條件為(25±1)℃,相對濕度40%～50%,自然晝夜比12h︰12h,非直接光照,自由飲食,用不含豆類的特殊飼料喂養(yǎng)2周。兔抗c-Fos多克隆抗體購于美國SantaCruz公司;免疫組化ABC試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;恒溫培養(yǎng)箱購于上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司,型號SPX-80BS-Ⅱ;切片機(jī)型號Leica1900;顯微鏡OlympusBX51。取上述大鼠40只,1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉后,經(jīng)腹部正中切口摘除雙側(cè)卵巢,建立去卵巢動物模型(OVX組)。其余40只雌性大鼠于腹部相同部位行正中切口,找到雙側(cè)卵巢后并不摘除,關(guān)閉腹腔,為假手術(shù)組(Sham組)。術(shù)后大鼠恢復(fù)2周。從OVX術(shù)后第3天開始,每天檢測陰道脫落細(xì)胞,連續(xù)檢查7d,判斷去卵巢手術(shù)是否成功。將OVX組大鼠利用隨機(jī)數(shù)字表均分為5組,每組8只,分別置入4,10,25,33和38℃5個不同環(huán)境溫度的恒溫恒濕溫度培養(yǎng)箱內(nèi)2h,相對濕度為60%,建立冷熱刺激動物模型。Sham組分組及溫度刺激條件同OVX組。(1)切片制備。經(jīng)上述步驟處理后的大鼠,立即用1%戊巴比妥鈉(80mg/kg)腹腔麻醉,暴露心臟,剪開右心耳,經(jīng)左心室插管至升主動脈,先用生理鹽水快速沖洗血液,再用含4%多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersolution,PBS;pH7.4,4℃)固定后立即取腦并置于含4%多聚甲醛的0.1mol/L的PBS4℃后固定4～6h,30%蔗糖的0.1mol/L的PBS內(nèi)(4℃)至沉底。恒冷箱切片機(jī)切取含下丘腦的腦冠狀切片,片厚30μm。每只大鼠選取3套切片。(2)免疫組化染色。采用ABC法進(jìn)行免疫組化染色,主要步驟:(1)第1套腦片0.5%TritonX-100在37℃孵育30min,沸水浴中修復(fù)抗原10min。0.3%H2O2室溫封閉15min,山羊血清孵育2h。(2)入兔抗c-Fos多克隆抗體(1︰300SantaCruz)室溫孵育48h。(3)入生物素化的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),室溫反應(yīng)2h。(4)入辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素生物素液,室溫反應(yīng)2h。(5)DAB顯色,免疫陽性產(chǎn)物為棕褐色。(6)裱片、室溫干燥、常規(guī)脫水、透明、封片,LeicaBX51鏡下觀察攝片。每換一種試劑均用PBS漂洗5min×3。陰性對照為第2套切片,用0.1mol/L的PBS代替一抗孵育,其余步驟同上。第3套切片用于Nissl染色,以便定位免疫組化染色的陽性結(jié)構(gòu)區(qū)域。切片在光鏡(BX51,Olympus,Japan)下觀察并應(yīng)用圖像分析儀(Quantimet570c,Leica,German)采集圖像。細(xì)胞定位參照參考文獻(xiàn),見圖1。Fos陽性細(xì)胞計數(shù)方法:先計數(shù)核團(tuán)內(nèi)c-Fos強(qiáng)陽性細(xì)胞和弱陽性細(xì)胞的總數(shù)以及核團(tuán)面積,再算出每個核團(tuán)單位面積的個數(shù)。細(xì)胞核深染呈深棕色,輪廓清晰者為強(qiáng)陽性;細(xì)胞核呈淺棕色,輪廓清晰者為弱陽性。每組8只大鼠,每只計數(shù)5張切片,取其平均值。(1)SO表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞密度在4,10,38℃時OVX組低于Sham組(P<0.01),見表1,圖2A～3B,其他溫度2組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。低于25℃時,Sham組SO表達(dá)c-Fos強(qiáng)陽性細(xì)胞密度隨著刺激溫度升高而減小;高于25℃時,則隨著刺激溫度升高而增大,呈現(xiàn)典型的以25℃為低點(diǎn)的“∨”字型結(jié)構(gòu)。低于25℃時,OVX組SO強(qiáng)陽性細(xì)胞密度隨著刺激溫度升高而減小;高于25℃時,則隨著刺激溫度升高而增大。SO表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞密度相鄰溫度間比較結(jié)果:Sham相鄰溫度之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。OVX組除4℃與10℃,33℃與38℃差異無統(tǒng)計學(xué)意義外,其余各相鄰溫度組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見表2。(2)SO表達(dá)c-Fos蛋白弱陽性細(xì)胞密度除4℃和38℃OVX組高于Sham組外(P<0.05),其他溫度點(diǎn)時2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。Sham組和OVX組弱陽性細(xì)胞密度隨溫度刺激的變化規(guī)律與強(qiáng)陽性細(xì)胞均類似。表達(dá)c-Fos蛋白弱陽性細(xì)胞密度相鄰溫度間比較結(jié)果:Sham組只有25℃與33℃之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。OVX組4℃與10℃和33℃與38℃差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2。(3)固定手術(shù)去勢因素,SO表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞密度在5個溫度點(diǎn),組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。固定溫度因素,表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞密度在Sham組與OVX組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。溫度因素和手術(shù)去勢因素有交互作用(P<0.01),見表3。固定手術(shù)去勢因素,SO表達(dá)c-Fos蛋白弱陽性細(xì)胞密度在5個溫度點(diǎn),組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。固定溫度因素,表達(dá)c-Fos蛋白弱陽性細(xì)胞密度在Sham組與OVX組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。溫度差異和手術(shù)去勢兩個因素?zé)o交互作用,見表3。(1)PVN表達(dá)c-Fos蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞密度除25℃兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外,其他溫度時OVX組均低于Sham組(P<0.05或P<