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小麥染色體c-分帶技術(shù)的研究進(jìn)展

1異染色質(zhì)的濃縮程度染色帶是一種用特定的染色過程中對(duì)染色帶的染色,具有不同的深度。生物細(xì)胞中有常染色質(zhì)和異染色質(zhì)之分,在細(xì)胞分裂過程中,異染色質(zhì)的濃縮程度要比常染色質(zhì)的濃縮程度高。在染色體分帶中,經(jīng)酸、堿、酶或高溫的處理后,DNA變性雙鏈打開,由于異染色質(zhì)區(qū)的復(fù)性速度快,易于染料結(jié)合染色較深,而常染色質(zhì)復(fù)性慢,結(jié)構(gòu)松散染色較淺,從而在染色體上出現(xiàn)深淺不一的帶紋。特定染色體有特定的帶紋,因此分帶技術(shù)可作為鑒別染色體組和單個(gè)染色體的手段,從而可以深入認(rèn)識(shí)染色體結(jié)構(gòu)成分和遺傳的關(guān)系。1.1小麥染色體中c-分帶染色體分帶技術(shù)中最初的顯帶是熒光顯帶,上世紀(jì)60年代末發(fā)明了Q顯帶技術(shù),它是將植物染色體經(jīng)芥子奎吖因(quinacrinemustard)處理后,在熒光顯微鏡下形成明暗不同的帶紋。1973年發(fā)明了另一種熒光顯帶技術(shù),Hoechst33258顯帶,其原理主要是基于染料分子與DNA分子中的堿基作用,從而顯帶。1970年,Fardue和Gall在研究中發(fā)現(xiàn)染色體著絲粒區(qū)可特殊顯帶,1971年Arrighi等在此基礎(chǔ)上建立了GiemsaC-分帶技術(shù)。Giemsa顯帶最早是在1970年應(yīng)用在哺乳動(dòng)物染色體上,1972年以后應(yīng)用在植物方面。1974年Gill和Kimber最先報(bào)導(dǎo)了黑麥染色體上的C-分帶技術(shù)。隨著制片技術(shù)的發(fā)展,分帶技術(shù)也在不斷改進(jìn)和完善,C-分帶技術(shù)已應(yīng)用于很多植物,尤其是麥屬植物中研究較為深入。研究表明,小麥染色體C-分帶帶型比較穩(wěn)定,并且重復(fù)性好。楊瑞武等利用改良的C-分帶技術(shù)分析了矮桿波蘭小麥的染色體帶型,發(fā)現(xiàn)在非同源染色體之間,帶型的數(shù)量、大小、強(qiáng)弱及其分布情況存在明顯差異。熒光顯帶也應(yīng)用到很多植物中,并且其操作簡(jiǎn)單,與其它的分帶技術(shù)存在異同。Liu等發(fā)展的DAPI熒光顯帶技術(shù)在染色體未經(jīng)化學(xué)處理的情況下,直接用DAPI進(jìn)行染色,在植物染色體上顯示出類似與Q-帶的豐富帶紋,且?guī)Ъy穩(wěn)定,無(wú)論是大基因組還是小基因組都能夠很好地顯示出帶紋。陳建民等對(duì)苜蓿染色體熒光分帶時(shí)發(fā)現(xiàn)DAPI帶型的數(shù)目和位置與C-帶基本相似,兩個(gè)二倍體的DAPI帶型明顯不同。1.2熒光顯帶是檢測(cè)dna結(jié)合能力的依據(jù)植物染色體GiemsaC-分帶是染色體經(jīng)過一定的酸、堿、酶或高溫處理后用Gimesa染料染色,使染色體在特定位置上出現(xiàn)深淺不一的帶紋,它是對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū)域染色。C-分帶是植物染色體研究中應(yīng)用最為廣泛的一種分帶方法,主要用于染色體的鑒別和核型分析,同時(shí)為物種親緣關(guān)系的鑒定提供依據(jù)。熒光顯帶是是根據(jù)熒光染料與DNA中AT、CG堿基結(jié)合能力的不同而在染色體上顯示出帶紋。如DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole,即4,6-二-2-苯基吲哚)、DA遠(yuǎn)霉素(DistamycinA)等與AT堿基特異結(jié)合,CMA色霉素(ChromomycinA3)、AMD即放線菌素D(ActinomycinD)等特異性與CG堿基結(jié)合,利用這種特異性的結(jié)合使染色體上不同部位出現(xiàn)熒光帶紋。熒光顯帶反映了染色體中DNA堿基組成的不同和變化。但有學(xué)者研究表明在局部環(huán)境下蛋白質(zhì)可能會(huì)影響染料與DNA的結(jié)合能力,同時(shí)也可能對(duì)熒光的激發(fā)和散射產(chǎn)生影響。GiemsaC-分帶技術(shù)在開創(chuàng)以來(lái)最先是在動(dòng)物細(xì)胞學(xué)研究方面應(yīng)用的比較多,隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善,如今已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到植物研究中,而且被應(yīng)用到的植物種類越來(lái)越多,技術(shù)和方法也越來(lái)越成熟,它在植物研究領(lǐng)域的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面。1.2.1小麥染色體核型以往進(jìn)行的核型分析只能根據(jù)染色體的形態(tài)特征(長(zhǎng)度、臂比、縊痕、隨體等)進(jìn)行區(qū)分,這種常規(guī)的分析方法有其自身的局限性,不能將物種的染色體一一區(qū)分開來(lái)。應(yīng)用分帶技術(shù)進(jìn)行植物染色體核型分析可以克服這些缺點(diǎn),能夠更加準(zhǔn)確區(qū)分染色體,準(zhǔn)確分析核型,從而為深入研究物種起源和遺傳關(guān)系等提供重要的細(xì)胞學(xué)資料。以研究最多的麥屬為例,普通小麥的染色體大小和臂比相近,常規(guī)方法難以區(qū)分,Gill等最早對(duì)小麥進(jìn)行了C-分帶,對(duì)其染色體進(jìn)行了區(qū)分。Endo等又用改進(jìn)的分帶方法對(duì)普通小麥分析,結(jié)果除了1A外的所有染色體都顯示出特異帶紋,使得各個(gè)染色體都能清楚辨認(rèn)。目前對(duì)于研究最多的黑麥來(lái)講,其染色體C帶核型特征已經(jīng)被確定。吳金華等對(duì)奧地利黑麥進(jìn)行C-分帶染色體核型分析發(fā)現(xiàn),除了2R和4R長(zhǎng)臂近端部約1/4處有帶且7R無(wú)中間帶外,其余帶型與黑麥標(biāo)準(zhǔn)C-分帶帶型基本一致。劉光欣等對(duì)8個(gè)大賴草材料進(jìn)行了C-分帶研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分染色體都顯示較強(qiáng)的末端帶,著絲粒帶和中間帶則不豐富。1.2.2小麥染色體易位鑒定由于不同物種的染色體顯帶不同,因此已將C-分帶技術(shù)應(yīng)用于植物遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程研究細(xì)胞學(xué)鑒定中。Gill和Kimber1974年首次利用C-分帶技術(shù)識(shí)別小麥的染色體易位,鑒別出6B/4A、1R/1D這類整臂易位類型。Gustafson等于1983年用C-分帶方法鑒定出小麥-黑麥的易位系,由帶紋的變化鑒定出大麥1RS染色體易位到小麥1AL、1BL上,但無(wú)法找到易位點(diǎn),易位長(zhǎng)度也無(wú)法估計(jì)。Darvery和Gustafson(1975)將C-分帶技術(shù)用于識(shí)別小麥-黑麥異附加系中的黑麥染色體,成功地識(shí)別了1R、3R、4R、5R和7R,而2R僅在某些品系中得以識(shí)別。1.2.3倍體的起源多倍體現(xiàn)象在生物界非常普遍,而且多倍化也是物種進(jìn)化和形成的重要途徑之一。通過對(duì)植物染色體進(jìn)行分帶,研究染色體形態(tài)和特征,可以用于探討多倍體植物的起源。Linde通過染色體帶紋相似性的比較,發(fā)現(xiàn)大麥屬的異源四倍體Hordeumreshevitzii(4x)可能是由H.reshecitxzii(2x)與H.califormicum(2x)相近種雜交形成。高云紅等對(duì)節(jié)節(jié)麥-黑麥雙二倍體以及親本節(jié)節(jié)麥、黑麥進(jìn)行C-分帶研究,結(jié)果顯示節(jié)節(jié)麥-黑麥雙二倍體的C-帶帶型與親本的基本相同,說(shuō)明該雙二倍體含有雙親的完整的染色體組,從而在細(xì)胞學(xué)水平上證實(shí)了該多倍體種質(zhì)的來(lái)源。2fish的應(yīng)用熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是一項(xiàng)分子生物學(xué)與細(xì)胞學(xué)相結(jié)合的技術(shù),目前在植物研究中的應(yīng)用較為廣泛。它是用特異性的核酸重復(fù)序列作為探針,用一定方法將其進(jìn)行熒光標(biāo)記,然后與被測(cè)目標(biāo)進(jìn)行雜交,通過熒光顯微鏡下可以觀察到特異的熒光信號(hào),從而對(duì)其進(jìn)行分析處理。2.1精確定位雜交1969年Gall和Pardue最先用放射性標(biāo)記的RNA探針定位特定的靶DNA序列,從而開創(chuàng)了RNA-DNA原位雜交技術(shù)。他們利用同位素標(biāo)記的DNA探針對(duì)非洲爪蟾的核內(nèi)rDNA在細(xì)胞制片上進(jìn)行檢測(cè)。由于同位素探針的高背景缺陷,限制了它對(duì)靶序列的精確定位。在原位雜交技術(shù)的開創(chuàng)初期,都是采用放射性同位素標(biāo)記探針,需要用放射性自顯影進(jìn)行檢測(cè),這種檢測(cè)上的限制和當(dāng)時(shí)分子克隆技術(shù)的缺乏使得它不能得到廣泛的應(yīng)用。因此在隨后的研究中,人們主要是在標(biāo)記方法和探針類型方面進(jìn)行改良和探索。1975年,Manning等最先在分子雜交中使用非放射性標(biāo)記,用細(xì)胞色素C將生物素與RNA分子連接起來(lái)。1977年,Rudkin發(fā)明了用間接免疫熒光檢測(cè)目的DNA的非同位素原位雜交(Nonisotopicinsituhybridization,NISH)。1981年,Langer等首次采用生物素標(biāo)記的核酸探針成功地進(jìn)行了染色體原位雜交。至此,以熒光標(biāo)記探針進(jìn)行基因原位雜交的技術(shù)趨于成熟。這項(xiàng)技術(shù)于1985年由Rayburn開始應(yīng)用于植物研究中,并不斷發(fā)展和完善,目前,該技術(shù)已應(yīng)用到植物研究的很多領(lǐng)域。2.2熒光雜交檢測(cè)熒光原位雜交技術(shù)的基本原理是在核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原則的基礎(chǔ)上,利用一定的物理或化學(xué)方法對(duì)核酸處理使其變性,用熒光染料標(biāo)記的核酸探針(DNA或者RNA序列)與染色體或DNA纖維上變性后的單鏈序列互補(bǔ)配對(duì),從而雜交在一起,然后用與熒光分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異結(jié)合,通過一定的檢測(cè)手段將熒光雜交信號(hào)在染色體或者DNA纖維上定位和分析。2.3異的探針序列隨著熒光原位雜交技術(shù)的不斷發(fā)展,特異的探針序列作為該技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵,針對(duì)不同植物和不同的研究目的也有很多的改進(jìn),主要是探針類型和標(biāo)記方法。2.3.1fps系統(tǒng)探針針對(duì)不同的研究對(duì)象或者目的,熒光原位雜交技術(shù)中的探針大致有以下幾種。(1)染色體特異性重復(fù)序列探針:在特異染色體類型上重復(fù)元件可達(dá)106拷貝數(shù),rRNA基因、端粒重復(fù)序列、著絲粒重復(fù)序列以及類似于α衛(wèi)星、衛(wèi)星Ⅲ類等都已經(jīng)被克隆,而且這種探針一般對(duì)應(yīng)的靶序列大于1Mb,與靶位點(diǎn)緊密結(jié)合形成高度濃縮的區(qū)域,因此易于檢測(cè),它通常用于快速檢測(cè)染色體非整倍體,如單體和三倍體。(2)單拷貝序列探針:此類探針針對(duì)基因組中單拷貝或者低拷貝的序列,通常是某個(gè)基因的DNA克隆、RFLP或RAPD標(biāo)記或是用大的插入片段,如柯斯質(zhì)?;蚪湍溉斯と旧w標(biāo)記。這些序列可以來(lái)自質(zhì)粒、粘粒、噬菌體PI載體、細(xì)菌人工染色體或酵母人工染色體克隆等。目前已經(jīng)有小到含有2kb目標(biāo)序列的質(zhì)粒探針用于FISH,然而由于雜交位點(diǎn)檢測(cè)率隨著探針大小的降低而降低,所以其雜交效率很小(20%-50%)。(3)總基因組探針:高等物種的基因組中含非常多的重復(fù)序列,而真正編碼的DNA序列只占很小的比例,而這些高中度重復(fù)序列的不同也代表了物種的特異性,然而并非所有的重復(fù)序列都有物種特異性,因此,利用某一物種的總基因組DNA作為探針,與另一物種的染色體進(jìn)行原位雜交,可用于分析異源多倍體基因組組成、起源、進(jìn)化和其親緣關(guān)系。(4)染色體文庫(kù)探針:由基因組DNA文庫(kù)中分離出的某一條或某一區(qū)域的核酸片段組成,可由克隆到噬菌體和粘質(zhì)粒上的染色體特異性大片段插入文庫(kù)制取,且此種探針片段小,與相鄰區(qū)域發(fā)生重疊及制片過程中被破壞的可能性小。這類探針可用于中期染色體重組和間期核結(jié)構(gòu)分析,以及鑒定染色體的異位和畸變等。(5)RNA探針:RNA探針主要用于RNA的原位雜交技術(shù)中。主要包括ssRNA探針和寡核苷酸RNA探針兩種,其中單鏈反義RNA探針廣泛應(yīng)用于組織切片和整體制備物上。由于RNA原位雜交是探針與細(xì)胞內(nèi)的特定mRNA雜交,故RNA探針的敏感性更強(qiáng),不需要變性,它與目標(biāo)RNA形成的雜交體比DNA探針的更緊密,同時(shí),它可用于鑒別一些特定序列如兩個(gè)相關(guān)密切的同源性mRNA(同型mRNA)。RNA探針比DNA探針更加具有優(yōu)越性,尤其是有義鏈可作為非特異性雜交的背景對(duì)照,因此它的應(yīng)用在RNA原位雜交中最為廣泛。2.3.2間接法與半抗原標(biāo)記方法比較在探針的標(biāo)記方法方面,FISH的探針標(biāo)記是由最初的放射性標(biāo)記方法發(fā)展而來(lái)的。放射性標(biāo)記方法雖然要求不高,且具有較高的靈敏度,但是其信號(hào)分析比較困難,又有放射性危害,所以逐漸被非放射性標(biāo)記所取代。FISH的標(biāo)記方法可分為直接法和間接法兩種。直接法是將熒光物直接標(biāo)記到核苷酸上,雜交后可被檢測(cè)到,而間接法是先在DNA探針上接半抗原,鏡檢前再用與半抗原特異結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。直接法雖然操作簡(jiǎn)單,干擾少,但是它得到的熒光信號(hào)不能被放大處理,因而靈敏度相對(duì)較低。直接法中常用的與核苷酸直接結(jié)合的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、羅明達(dá)衍生物(TRITC)、氨甲基香豆素醋酸酯(AMCA)等。在間接法中常用的半抗原為生物素和地高辛。其標(biāo)記方法有很多如缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCR或RNA體外轉(zhuǎn)錄法,標(biāo)記長(zhǎng)度一般為200-400bp。生物素是最早用到的中間標(biāo)記物,與生物素結(jié)合的核苷酸探針可用結(jié)合有熒光素的親和素(avidin)和鏈親和素(streptavidin)檢測(cè)。由于在原核生物和真核生物中普遍存在著內(nèi)源性生物素的干擾,抗生物素蛋白對(duì)非流動(dòng)性基質(zhì)存在非特異性結(jié)合,因此提高了標(biāo)記成本,降低了靈敏度,于是后來(lái)發(fā)展了以地高辛標(biāo)記。地高辛標(biāo)記的探針可用連有熒光素的抗地高辛抗體檢測(cè),由于它靈敏度高,因此得到廣泛的應(yīng)用。2.4dna的分離純化在熒光原位雜交中針對(duì)不同的研究對(duì)象和目的與探針雜交的靶也有不同的類型。(1)中期染色體:最早應(yīng)用以及應(yīng)用最普遍的靶就是中期染色體。由于在細(xì)胞有絲分裂中期的染色體可以用傳統(tǒng)的染色體制片技術(shù)獲得,而且可以非常清晰地觀察到單條染色體。隨著染色體制片技術(shù)的逐漸發(fā)展和成熟,以中期染色體為探針的靶序列進(jìn)行原位雜交分析就更加簡(jiǎn)單,也使得原位雜交的技術(shù)應(yīng)用范圍更加廣泛。但由于中期染色體高度濃縮,因此分辨率相對(duì)較低。(2)間期細(xì)胞核:相對(duì)中期的染色體來(lái)說(shuō)間期的細(xì)胞核中的染色質(zhì)濃縮程度要低很多,因此其原位雜交的分辨率要比分裂期高。但由于細(xì)胞核本身具有一定的空間結(jié)構(gòu)使得分辨率在50kb左右,要突破這個(gè)限度就需要打破其原有的結(jié)構(gòu),并且間期的細(xì)胞核不具有染色體結(jié)構(gòu),在應(yīng)用范圍上也受到了一定的限制。(3)游離染色質(zhì):前面提到為了提高分辨率要打破細(xì)胞核的原有結(jié)構(gòu),因此有人提出,用堿性溶胞劑(alkalinelysisbuffer)對(duì)處于G1和G2期之間的間期細(xì)胞核進(jìn)行處理,釋放出游離的染色質(zhì)絲,人為地改變其結(jié)構(gòu),使得其中DNA的濃縮程度進(jìn)一步降低。試驗(yàn)結(jié)果表明,這種方法能夠使分辨率接近10kb,能夠分析1Mb范圍內(nèi)的DNA序列的位置關(guān)系。(4)DNA纖維:DNA纖維作靶是將單細(xì)胞的懸浮液涂抹在載玻片上,然后用堿性變性劑將染色體結(jié)構(gòu)破壞,使DNA分子與復(fù)合的蛋白質(zhì)分離開來(lái),這樣就形成了游離的DNA纖維,因此雜交后的信號(hào)不再是單個(gè)的點(diǎn),而是許多點(diǎn)組成的線,通過測(cè)量信號(hào)的長(zhǎng)度能夠估計(jì)出探針分子的長(zhǎng)度。這種以DNA纖維為靶與探針雜交的方法具有快速、直接和簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),在1Mb的DNA范圍內(nèi),其分辨率能達(dá)到1-2kb,但其不足之處在于不能闡明靶序列相對(duì)于著絲粒、端粒和異染色質(zhì)塊等染色體標(biāo)記的位置和取向,如果沒有已知位置的DNA標(biāo)記的共定位則不能鑒別染色體。2.5原聚光刻技術(shù)的應(yīng)用2.5.1熒光原位雜交技術(shù)在物種親緣關(guān)系的鑒定方面,在核型分析的基礎(chǔ)上,通過對(duì)基因組的整體分析檢測(cè)可以更加明確地對(duì)其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行比較。以分帶技術(shù)的染色體核型進(jìn)行對(duì)比,并且結(jié)合原位雜交技術(shù),用特異重復(fù)DNA序列作為探針進(jìn)行原位雜交,為研究相關(guān)類群之間的基因組關(guān)系,鑒定體細(xì)胞雜種間的親本基因組提供了一種可選擇的途徑。Schwarzacher等用非洲黑麥(Secaleafricanum)的基因組DNA作探針,與雜種(Secaleafricanum×Hordeumchilense)的根尖染色體雜交,發(fā)現(xiàn)有7條大的染色體來(lái)自于非洲黑麥,另外7條則來(lái)自于H.chilense。同時(shí),還在間期細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的基因組在細(xì)胞核中不是隨機(jī)混合的,而是各自占據(jù)了一個(gè)確定的區(qū)域。Uozu等以O(shè).australiensis特異重復(fù)序列RIRE1作探針,用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)O.sativa×O.australiensis的回交后代進(jìn)行檢測(cè),十分清楚地區(qū)別出后代25條染色體中12條來(lái)自O(shè).sativa,13條來(lái)自O(shè).australiensis。其次,熒光原位雜交技術(shù)在同源和異源多倍體的研究中得到很好地應(yīng)用。多倍體物種在自然界廣泛存在,鑒別它們的供體基因組及外源染色體是親緣關(guān)系研究的重要方面。傳統(tǒng)的染色體水平的研究是根據(jù)核型和分帶特征來(lái)推測(cè)不同物種之間的演化關(guān)系,但是在一些時(shí)候,這些特征數(shù)據(jù)常常不穩(wěn)定,一些屬的植物之間核型較相似,難以提供識(shí)別供體基因組的有效依據(jù),如菊屬,而植物染色體的分帶技術(shù)在目前也沒能做到像分析人類染色體帶型那樣穩(wěn)定、清楚。染色體原位雜交從理論上來(lái)說(shuō)可以解決上述問題。自Schwarzacher用GISH的方法在雜種中鑒別出供體基因組以后,已在許多的作物及野生植物中得到應(yīng)用。燕麥(Avenasativa)是一個(gè)典型的異源多倍體種,傳統(tǒng)的核型分析和減數(shù)分裂染色體配對(duì)行為的觀察認(rèn)為,它是由AACCDD基因組組成。A和C分別來(lái)源于A.strigosa和A.ventricosa,剩下的即為D組,但不知來(lái)源于哪個(gè)二倍體種。分別用A.strigosa和A.pilosa的總DNA作探針進(jìn)行基因組原位雜交,結(jié)果表明,A.pilosa標(biāo)記了C組,A.strigosa標(biāo)記了A和D組,進(jìn)一步研究表明,A組和D組的同源性要較C組的高。親緣關(guān)系研究中還常根據(jù)雜種減數(shù)分裂時(shí)的染色體配對(duì)行為來(lái)判斷基因組的來(lái)源,但是當(dāng)這種雜交由于某種原因而失敗時(shí),原位雜交就提供了一種有效的手段。Miliummontianum(2n=22)是一個(gè)典型的二型核型種,由8條大的染色體(L-)和14條較小的染色體(S-)組成。核型分析肯定了S-的來(lái)源,但無(wú)法確定L-是否來(lái)源于M.vernale(2n=8)或其近緣種。二倍體的M.vernale無(wú)法和M.montianum雜交,也不能用減數(shù)分裂時(shí)染色體配對(duì)行為來(lái)分析L-染色體是否來(lái)源于M.vernale。當(dāng)以M.vernale的總DNA為探針進(jìn)行原位雜交,在M.montianum的根尖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)所有的L-染色體均顯示了雜交信號(hào),而S-染色體沒有信號(hào),這就確定了異源四倍體種M.montianum的L-染色體來(lái)源于M.vernale或其近緣種。在小麥屬中,Liu等對(duì)不同的小麥類型和普通小麥進(jìn)行顯帶比較和原位雜交分析,在其起源和進(jìn)化上也得到很好的分析結(jié)果。2.5.2種植物葉片原位雜交分析結(jié)果熒光原位雜交技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于植物特定的基因定位中。目前研究較多的是植物基因組中核糖體基因5SrDNA,25SrDNA,45SrDNA等在染色體上的定位。馬有志等以黑麥品種Petkus的細(xì)胞核為模板,擴(kuò)增了45SrDNA基因中的18SrDNA基因,并以其為探針,采用熒光原位雜交技術(shù),將45SrDNA基因定位在了染色體1R的1RS1.3處附近(即隨體附近)。廖進(jìn)秋等以45SrDNA和5SrDNA基因?yàn)樘结槍?duì)波蘭小麥和矮蘭麥進(jìn)行了熒光原位雜交分析,結(jié)果表明,高桿波蘭小麥、矮桿波蘭小麥和矮蘭麥的45SrDNA基因位點(diǎn)高度一致,都在隨體染色體短臂的核仁組織區(qū)(NOR)顯示出4個(gè)位點(diǎn),5SrDNA基因在高桿波蘭小麥和矮蘭麥染色體上表現(xiàn)一致,都顯示出6個(gè)基因位點(diǎn),而在矮桿波蘭小麥中顯示出8個(gè),較前兩種多出2個(gè)基因位點(diǎn),且獨(dú)立于一對(duì)染色體短臂上。王嵐對(duì)誘導(dǎo)的多倍體新麥草進(jìn)行原位雜交分析發(fā)現(xiàn),新麥草基因組中主要在3對(duì)染色體上具有45SrDNA位點(diǎn),分別位于第Ⅰ、第Ⅲ和第Ⅴ染色體短臂末端,初步推測(cè)是NOR染色體。目前,還分別在火柴頭(又稱竹葉菜、飯包菜、蘭姑草)、苜蓿、加州野生麥、百合、沙田柚等植物上實(shí)現(xiàn)了45SrDNA基因的定位。另外,對(duì)于一些植物存在一定的如抗病,抗旱等良好的抗逆性狀,這些性狀都是由其一定的抗性基因決定的。因此如能夠?qū)⑦@些特定的抗性基因進(jìn)行定位分析,并將其提取出來(lái),再利用基因工程的手段對(duì)基因進(jìn)行克隆雜交,從而可以在植物育種中有極大的幫助,使得得到具有良好抗性的新的雜種后代成為可能。如今很多抗性基因已經(jīng)在許多植物中定位出來(lái),如王金平等對(duì)小濱麥易位系小麥山農(nóng)0096進(jìn)行抗條銹病基因的定位研究,將導(dǎo)入的抗條銹病基因定位在了4A染色體上。鐘筱波等用生物素標(biāo)記的Arabidopsisthaliana端粒重復(fù)序列探針PatT4和地高辛標(biāo)記的番茄端粒聯(lián)接重復(fù)序列TGR1對(duì)番茄進(jìn)行熒光原位雜交,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PatP4探針雜交到所有番茄染色體端粒上,TGR1只雜交在24個(gè)端粒中的20個(gè)上,其中第1、2、7條染色體的長(zhǎng)臂和第2條染色體的斷臂不含TGR1序列。2.5.3小黑麥普通小麥的分子檢測(cè)利用熒光原位雜交技術(shù)與分帶技術(shù)結(jié)合能夠?qū)τ谥参镏械囊孜幌底龅礁尤娴蔫b定,沒有易位片段的長(zhǎng)度的限制。石云素等用FISH技術(shù)檢測(cè)了小麥背景中的1B/1R易位。他們以黑麥總基因組DNA做探針,檢測(cè)了小黑麥×普通小麥的3個(gè)衍生系930553、930560、930612的黑麥染色質(zhì),發(fā)現(xiàn)都有1RS染色體臂與一小麥染色體臂發(fā)生易位,且斷點(diǎn)在著絲點(diǎn)附近。元增軍等對(duì)小麥和黑麥的易位系雜交后代(1RS-1RL與6VS-6AL易位系雜交)用C-分帶和雙色熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行了鑒定,在F2中鑒定出小麥-黑麥-簇毛麥雙重易位純合體,且證實(shí)該易位系具有良好的細(xì)胞學(xué)穩(wěn)定性,從而得到了有正常育性,有良好的農(nóng)藝性和白粉病抗性的易位系。2.5.4書生基因整合隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)基因植物不斷增多,FISH技術(shù)不僅能用于檢測(cè)外源基因是否存在,而且還能將外源基因直接定位在染色體的相應(yīng)位置并確定其拷貝數(shù),同時(shí)也是轉(zhuǎn)基因植株的遺傳不穩(wěn)定性、細(xì)胞基因表達(dá)和調(diào)控機(jī)理的重要研究手段之一。金危危等利用熒光原位雜交,在供試8個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系的染色體上檢出了轉(zhuǎn)入的外源基因barnase-psI片段,其中兩株系各檢出了兩個(gè)不同的信號(hào)位點(diǎn),而其他株系均只檢出一個(gè)信號(hào)位點(diǎn),所有染色體著絲粒區(qū)都沒有雜交信號(hào)。結(jié)合Southern雜交及表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)株系中,整合在染色體端部區(qū)的barnase-psI基因表現(xiàn)為高水平表達(dá),而靠近著絲粒區(qū)的則表現(xiàn)為低水平表達(dá),表明表達(dá)水平與轉(zhuǎn)基因整合位置可能一定程度的相關(guān)性,表達(dá)水平與拷貝數(shù)無(wú)明顯相關(guān)。Jin等利用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)并定位了轉(zhuǎn)入水稻中的殺蟲蛋白基因,雜交信號(hào)分散于距著絲粒26.2-95.2之間。Wang等利用該技術(shù)研究了轉(zhuǎn)基因矮牽牛中T-DNA的插入位置,發(fā)現(xiàn)T-DNA大部分整合在著絲粒遠(yuǎn)端常染色質(zhì)區(qū)。Pedersen等利用FISH技術(shù)找到了T-DNA在轉(zhuǎn)基因大麥、小麥和小黑麥染色體上優(yōu)先整合的位點(diǎn),整合趨向于染色體的遠(yuǎn)端區(qū)。大量的FISH研究表明,外源基因在染色體上的整合不是隨機(jī)的,而是優(yōu)先整合到染色體的遠(yuǎn)端區(qū)。FISH技術(shù)特別是Fiber-FISH技術(shù)還可以顯示轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。目前的研究表明,小麥中外源基因可能有3種插入形式,分別為串聯(lián)重復(fù)整合、串聯(lián)重復(fù)拷貝之間夾雜著基因組和單個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝。有報(bào)道根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中外源基因的插入位點(diǎn)數(shù)少,一般只有1個(gè),而基因槍轉(zhuǎn)化中可看到1個(gè)以上的外源基因插入位點(diǎn)。鑒于轉(zhuǎn)基因植物的遺傳不穩(wěn)定性,整合位點(diǎn)與其表達(dá)有關(guān),對(duì)于整合位點(diǎn)的確定對(duì)于穩(wěn)定的表達(dá)具有一定的意義。FISH技術(shù)在基因工程方面的應(yīng)用結(jié)合C-分帶技術(shù),使得操作起來(lái)更加全面準(zhǔn)確,因?yàn)樵谶@方面的要求比較高的靈敏度和精確度。Schwarzacher等(1992)在小麥中定位了外源染色體、染色體片段和染色體的結(jié)構(gòu)變異等。Cuadrado等(1996)采用C-分帶原位雜交技術(shù),成功地鑒定了小麥中黑麥基因的遺傳滲透。2.5.5小麥染色體的檢測(cè)在對(duì)許多植物的染色體核型分析研究中,僅僅靠外部形態(tài)結(jié)構(gòu)很難對(duì)各條染色體進(jìn)行精密的分析,尤其對(duì)于一些染色體外型比較單一,而且非常細(xì)小的植物更是如此。隨著染色體分帶技術(shù)和FISH的發(fā)展,利用C-分帶和FISH技術(shù)相

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