脾胃胃黏膜對脾胃相關生長抑素的影響

脾胃胃黏膜對脾胃相關生長抑素的影響

脾虛證是指以胃腸道病理改變和功能障礙為主的多器官系統(tǒng)功能障礙綜合征。根據(jù)中醫(yī)的辨證分型,脾虛證又分為脾氣(陽)虛、脾陰虛等。對于脾虛證本質(zhì)的研究,一直是眾多學者長期研究的問題。以往的研究以及我室的前期實驗表明,消化道D細胞合成和分泌生長抑素(somatostatin,SOM)的能力增強是造成脾氣虛證的重要原因之一。但是,SOM是通過怎樣的途徑影響機體而發(fā)生脾氣虛證的?在此方面尚缺乏深入的研究。細胞信號傳遞是機體生理和病理變化中的基本過程,我們推測,脾氣虛胃潰瘍病時細胞信號傳遞也有相應的變化。因此,本實驗從信號傳遞的角度出發(fā),觀察了脾氣虛胃潰瘍模型大鼠胃黏膜SOM及其受體,以及受體后的信號分子細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)的變化,以期從分子水平探討脾氣虛胃潰瘍的發(fā)病機制。材料和方法1.藥代動力學模型建立取成年Wistar(Ⅱ級)大鼠雌性、雄性各35只,體重170～220g。以厚樸三物湯為致虛藥,用耗氣破氣加饑飽失常法建立脾氣虛模型。造模第10天用冰醋酸法實施胃潰瘍手術,術后將動物隨機分為脾氣虛胃潰瘍組、自然恢復組、治療組;對照組以等量生理鹽水代替冰醋酸模擬胃潰瘍手術。術后,脾氣虛胃潰瘍組繼續(xù)給予致虛藥,治療組交替給予致虛藥和治療藥(加味四君子湯),自然恢復組、對照組正常飼養(yǎng)。2.剪開、冷凍存液于潰瘍手術后第4天和第14天取各組大鼠胃。將胃沿小彎剪開,固定于塑料板上,沿胃大彎剪開成兩半,一半胃入液氮驟冷后冷凍存于-80℃冰箱中待用;另一半胃入Bouin液固定后,常規(guī)石蠟包埋,制成5μm厚的連續(xù)切片。3.he染色取大鼠胃石蠟組織切片,常規(guī)HE染色。4.細胞表型的制備取大鼠胃石蠟組織切片60℃烤1h,常規(guī)脫蠟入水。3%H2O2-甲醇,室溫30min,PBS洗3次,每次5min。1∶20正常羊血清封閉,濕盒內(nèi)室溫30min,不洗。入SOM抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司,工作濃度為1∶250)4℃冰箱過夜,PBS洗3次,每次5min。PV-6001試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司,工作濃度為1∶1)室溫20min,PBS洗3次,每次5min。DAB-H2O2液顯色后,蒸餾水終止反應,Mayer蘇木素復染細胞核。常規(guī)脫水透明,加拿大樹膠封片。用PBS代替一抗作空白對照。5.sst2pcr擴增使用的器材事先經(jīng)滅活RNA酶處理。從-80℃的冰箱中取出大鼠胃組織,置于玻璃平皿上,用冷PBS沖洗數(shù)次后,用鋒利手術刀片迅速刮下胃黏膜,取適量放入1.5ml離心管內(nèi)。經(jīng)過(1)提取總RNA并鑒定;(2)進行反轉錄反應:反應總體系20μl,含有總RNA1μg,加入0.5μgRandomPrimer,室溫放置10min,70℃水浴加熱10min,取出后迅速置冰內(nèi)冷卻。合成的cDNA進行PCR擴增;(3)PCR擴增反應:sst2及內(nèi)參照GAPDH引物均根據(jù)GenBank登錄的大鼠目的基因cDNA序列,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。具體如下:sst2上游引物5′-TTgACggTCATgAgCATCg-3′,下游引物5′-ACAgACACggACgAgACATTg-3′,擴增產(chǎn)物為449bp。GAPDH上游引物5′-ggTgCTgAgTATgTCgTggAg-3′,下游引物5′-ATgCAgggATgATgTTCTgg-3′,擴增產(chǎn)物大小為338bp。PCR擴增反應體系:反應總體系20μl,含有cDNA1μl,上游、下游引物各2μl,2.5mmol/LdNTPMixture1.6μl,10×ExTaqBuffer(華美生物工程公司)2μl,ExTaq1U。PCR反應條件:sst294℃預變性2min;94℃變性40s,58℃退火40s,72℃延伸45s,循環(huán)30次;72℃總延伸1min。GAPDH94℃預變性2min;94℃變性40s,53℃退火45s,72℃延伸45s,循環(huán)25次;72℃總延伸1min。(4)PCR產(chǎn)物測定及分析:PCR反應產(chǎn)物于1%瓊脂糖中電泳,用Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝片。6.acid蛋白提取實驗時從-80℃冰箱中取出凍存的大鼠胃標本,盛于干凈的平皿中,置于冰盒上,待組織解凍后迅速用鋒利的手術刀片刮下胃黏膜,置于離心管內(nèi)。加組織裂解液(50mmol/LTris-ClpH7.5,2mmol/LEDTA,2mmol/LEGTA,50nmol/LOkadiacAcid,2%SDS),用手持式組織勻漿器和UltrasonicProcessor裂解組織,提取總蛋白。用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce)測定組織提取液的蛋白濃度。每例標本取50μg蛋白,經(jīng)過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、分離后,電轉移至硝酸纖維素膜(NC膜,Bio-Rad)上,10%脫脂奶封閉后,按1∶1000的比例加一抗(抗phospho-ERK1,2,小鼠抗兔單克隆抗體,NEB公司),室溫下與NC膜雜交3h后,用TTBS緩沖液漂洗膜10min×3次;按1∶4000的比例加入二抗(HRP標記羊抗小鼠IgG,Jackson),室溫雜交1h后,TTBS緩沖液漂洗膜10min×3;ECL試劑盒顯帶曝光、顯影和定影。取出NC膜,用TTBS洗10min,50～70℃條件下用洗脫液在恒溫搖床上洗30min。用TTBS洗膜10min×2。用抗ERK1,2的一抗(Promega)與NC膜雜交及顯跡,步驟及抗體工作濃度同上述。7.統(tǒng)計處理7.1大鼠胃黏膜中平均粒度的測定用LiecaQ5501W軟件進行圖像半定量分析,每張切片隨機取5個視野,測定大鼠胃黏膜中SOM蛋白的平均灰度值。實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。7.2sst2mrna的表達用Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)分別檢測sst2和GAPDH條帶的吸光度,根據(jù)sst2與GAPDH的吸光度比值對sst2mRNA在各組之間的表達水平進行半定量分析。對各組之間的比值進行秩和檢驗。7.3erk2磷酸化度測定用Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)分別對X線片上phospho-ERK2與ERK2的條帶進行吸光度掃描分析,算出各組phospho-ERK2密度與ERK2密度的比值,以百分數(shù)表示各組的ERK2磷酸化程度。實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。結果1.大鼠胃黏膜及黏膜下層病變情況對照組大鼠胃壁組織結構正常(圖1)。造模后第4天,大鼠胃黏膜及黏膜下層出現(xiàn)以滲出、壞死層為主的病變(圖2);造模后第14天,大鼠胃黏膜及黏膜下層以肉芽組織層和瘢痕組織為主(圖3)。2.兩組細胞免疫反應產(chǎn)物的檢測結果SOM陽性反應產(chǎn)物為棕色,位于細胞質(zhì)內(nèi),細胞核陰性。陽性細胞主要位于大鼠胃竇黏膜的下1/3,偶見于大鼠胃黏膜中、上部。以PBS代替一抗的對照片為陰性。圖像分析采用平均灰度值測定SOM陽性細胞免疫反應產(chǎn)物的含量。平均灰度值與免疫反應產(chǎn)物的含量成反比,即陽性細胞的免疫反應產(chǎn)物的含量越少,染色越淺,平均灰度值越高。圖像分析結果表明,與第4天對照組(圖4)比較,脾氣虛胃潰瘍組(圖5)SOM陽性細胞的平均灰度值明顯減弱(P<0.01),自然恢復組(圖6)、治療組(圖7)SOM陽性細胞的平均灰度值減弱(P<0.05)。與第14天對照組(圖8)比較,脾氣虛胃潰瘍組(圖9)、自然恢復組(圖10)SOM陽性細胞的平均灰度值明顯減弱(P<0.01),治療組(圖11)SOM陽性細胞的平均灰度值升高,與對照組比較無顯著性差異(P>0.05);與第14天脾氣虛胃潰瘍組、自然恢復組比較,治療組SOM陽性細胞的平均灰度值升高并接近對照組水平,前者P<0.01,后者P<0.05。與同組第4天比較,第14天脾氣虛胃潰瘍組SOM陽性細胞的平均灰度值下降(P<0.05),而治療組SOM陽性細胞的平均灰度值升高(P<0.05)。結果見表1。3.rt-pcr擴增帶圖12和13中,在300～400bp和400～500bp之間分別有一條清晰的擴增帶,分別為sst2和內(nèi)參照GAPDH的RT-PCR產(chǎn)物。將所得條帶進行吸光度檢測,所得結果見表2。4.兩組大鼠erk2的磷酸化水平比較圖14和15為各組大鼠胃黏膜層蛋白提取物與ERK2的磷酸化抗體雜交后的結果,大鼠胃黏膜中的ERK以ERK2為主;與第4天對照組比較,脾氣虛胃潰瘍組、治療組、自然恢復組動物ERK2的磷酸化水平降低。與第14天對照組比較,脾氣虛胃潰瘍組、自然恢復組大鼠ERK2的磷酸化水平也減弱;與第14天自然恢復組相比,治療組大鼠ERK2的磷酸化水平升高。圖16和17為同一張NC膜將磷酸化抗體洗脫掉后與ERK的總抗體雜交后的結果,各組總量大體一致。用GelDoc凝膠成像系統(tǒng)分別對其進行定量分析,算出各組被磷酸化的ERK2占總ERK2的百分比,經(jīng)統(tǒng)計學處理后結果為:與第4天對照組比較,脾氣虛胃潰瘍組、自然恢復組動物磷酸化水平降低(P<0.05),治療組ERK2的磷酸化水平回升,與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。與第14天對照組比較,脾氣虛胃潰瘍組、自然恢復組ERK2的磷酸化水平降低(P<0.05),治療組ERK2的磷酸化水平升高,與對照組之間無顯著性差異(P>0.05);與第14天脾氣虛胃潰瘍組、自然恢復組比較,治療組ERK2的磷酸化水平升高(P<0.01)。與同組第4天比較,第14天脾氣虛胃潰瘍組對ERK2的磷酸化水平下降(P<0.05),治療組ERK2的磷酸化水平升高(P<0.05)。結果見表3。討論1.對特殊的特殊模型的制作本實驗所制作的脾氣虛胃潰瘍大鼠模型是一種“證病結合模型”。選擇該動物模型進行研究,是因為“脾虛證”是中醫(yī)臨床常見的一類以消化道病理改變和功能障礙為主的多系統(tǒng)多功能紊亂的綜合癥候群,臨床上單純脾虛證的患者少見,往往合并胃潰瘍等消化系統(tǒng)病?！捌馓撐笣兡Ｐ汀闭悄M臨床脾氣虛胃潰瘍患者的癥狀而制作的,該模型既具有脾虛證的表現(xiàn),又具有胃潰瘍的體征,使脾虛證癥候體現(xiàn)于具體的疾病上,從而使脾虛證的研究更接近于臨床實踐,更緊密聯(lián)系臨床。從辨證分型的角度出發(fā),脾虛證分為“脾氣(陽)虛”、“脾陰虛”等。本實驗采用的耗氣破氣加饑飽失和冰醋酸法制作的“脾氣虛胃潰瘍”模型是目前公認的制作脾氣虛胃潰瘍動物模型的方法之一,也是我們實驗室長期使用的方法。造模后,動物出現(xiàn)便溏、體重下降、毛色枯槁、拱背等典型脾氣虛證證狀和壞死、滲出、增生的胃潰瘍的病理表現(xiàn),說明模型制作可靠;經(jīng)加味四君子湯治療后癥狀改善,反證了模型制作的可靠。2.胃黏膜sst2基因轉錄和erk活性的關系本實驗結果表明,脾氣虛胃潰瘍時,大鼠胃黏膜D細胞內(nèi)SOM含量增加。本實驗室前期的研究結果表明,“單純脾虛證”、“單純胃潰瘍”、“脾氣虛合并胃潰瘍”動物模型中,胃黏膜SOM的合成、分泌均增加,但以“脾氣虛合并胃潰瘍”組增加最顯著。因此我們認為,在脾氣虛胃潰瘍時,D細胞合成、分泌SOM的能力增強是一項重要的病理變化。這與被普遍認為的SOM合成、分泌增加是脾氣虛一項重要的病理基礎的觀點一致。SOM通過與其特異性受體結合而發(fā)揮生物學作用。生長抑素受體包括6種亞型,即sst1、sst2A、sst2B、sst3、sst4、sst5,它們都屬于7跨膜G蛋白耦聯(lián)受體家族。本實驗運用RT-PCR的方法檢測了胃黏膜sst2mRNA的表達,并采用單因素方差分析對實驗結果進行了統(tǒng)計學分析,結果顯示各組之間差異不明顯;我們又采用了秩和檢驗對實驗結果進行統(tǒng)計學分析,結果表明,脾氣虛胃潰瘍大鼠胃黏膜sst2的基因轉錄較對照組增強。我們認為,采用單因素方差分析得到差異無統(tǒng)計學意義的原因可能是:(1)動物樣本量不夠大;(2)sst有6種類型,在脾氣虛胃潰瘍時,sst2可能只是SOM發(fā)揮作用的途徑之一,還存在著SOM與其他亞型的受體結合發(fā)揮作用的途徑;(3)在mRNA表達發(fā)生變化的同時,SOM可能在細胞分布上也發(fā)生了變化,可能有更多的sst2從胞膜向胞質(zhì)轉移,從而使SOM的抑制作用加強。生長抑素與其受體結合后,通過調(diào)節(jié)K+通道、Ca2+通道、腺苷環(huán)化酶、磷酸酶、有絲分裂原激活的蛋白激酶MAPK(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)的活性等多種途徑進行信息傳遞。本研究發(fā)現(xiàn),脾氣虛胃潰瘍時,胃黏膜SOM合成、分泌增加,sst2的基因轉錄增強,伴隨著ERK2的磷酸化水平下降。磷酸化形式的ERK是有活性的ERK,因此我們分析,在胃黏膜,SOM與相應受體結合后可能通過調(diào)節(jié)ERK的活性進行信息傳遞。同時,在脾氣虛胃潰瘍時,SOM合成、分泌增加抑制了ERK的活性。這一結果與Sellers等的研究結果相似。ERK屬于MAPK家族,磷酸化后轉變?yōu)橛谢钚缘腅RK,具有激活轉錄因子、調(diào)節(jié)特定基因表達的功能,參與細胞生長、發(fā)育、分裂及細胞間的功能同步等多種生理過程。結合我們的實驗結果,我們認為,在脾氣虛胃潰瘍組潰瘍區(qū)胃黏膜上皮的修復較對照組、治療組慢,可能與ERK活性受到抑制有關。同時,也有文獻報道,脾氣虛狀態(tài)下MAPK信號轉導通路在大鼠不同組織中發(fā)生不同的變化,心、腦組