環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌新型試劑盒研制可行性研究報(bào)告

更多下載盡在我的主頁(yè)更多下載盡在我的主頁(yè)專業(yè)打造專業(yè)打造環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌型試劑盒研制可行性爭(zhēng)論報(bào)告李思光一、選題的必要性1、工程所處技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)政策本工程屬生物高技術(shù)領(lǐng)域，是國(guó)家重點(diǎn)支持的爭(zhēng)論領(lǐng)域，工程主要針對(duì)嚴(yán)峻影響人類安康的主要病原菌的檢測(cè)與診斷需要進(jìn)展檢權(quán)的科研成果。本工程技術(shù)含量高，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，工程完成后能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，工程符合國(guó)家產(chǎn)業(yè)、技術(shù)政策。2、工程所處技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)呈現(xiàn)狀目前的病原菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、準(zhǔn)確性低，開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確題。本工程針對(duì)病原菌檢測(cè)中存在的問(wèn)題，承受高靈敏度、高特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)試劑。3、工程技術(shù)先進(jìn)性，對(duì)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)步的推動(dòng)作用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是利用4個(gè)特別設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性DNADNA1h109LAMP推動(dòng)作用。4、工程目前進(jìn)展?fàn)顩r課題組開(kāi)展了大量前期爭(zhēng)論工作，已完成了本工程所需的科研了根底。二、技術(shù)方案論述〔一〕工程技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)和創(chuàng)點(diǎn)，工程完成時(shí)到達(dá)的技術(shù)水平1、技術(shù)關(guān)鍵〔1R6局部病原菌的基因組DNA，并依據(jù)基因組特點(diǎn)承受等溫?cái)U(kuò)增軟件設(shè)計(jì)了局部引物，現(xiàn)正通過(guò)試驗(yàn)確定這些引物的性能?！?〕本工程的另一技術(shù)關(guān)鍵是最正確等溫?cái)U(kuò)增體系優(yōu)化。通過(guò)對(duì)引物濃度、內(nèi)引物和外引物的最正確濃度比、模板濃度、dNTPBstDNA聚合酶用量、Mg2+濃度等條件進(jìn)展優(yōu)化，能夠獲得最正確試驗(yàn)條件。2、創(chuàng)點(diǎn)〔1〕既往對(duì)病原菌的檢測(cè)一般承受細(xì)菌分別培育鑒定法，但該方法的準(zhǔn)確率低，所需時(shí)間長(zhǎng)，往往延誤臨床正確的診斷和治療。近PCRPCRPCR方增法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。而且，等溫?cái)U(kuò)增法是在恒溫下進(jìn)展，只需一個(gè)簡(jiǎn)潔的恒溫裝置，不需要PCR試驗(yàn)中的昂貴儀器，因而易于在基層食品質(zhì)量檢測(cè)部門(mén)和醫(yī)院推廣使用?！?〕目前，國(guó)外已有將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于病毒DNARNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，以抑制當(dāng)前一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增反響只能檢測(cè)一種DNA或RNA的缺點(diǎn)。因此，本工程的實(shí)施，將開(kāi)發(fā)出具有自主學(xué)問(wèn)產(chǎn)權(quán)的病原菌檢測(cè)試劑盒。3、工程完成時(shí)到達(dá)的技術(shù)水平工程完成時(shí)，開(kāi)發(fā)的多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌技術(shù)及其配套試劑盒到達(dá)國(guó)際先進(jìn)水平。〔二〕工程技術(shù)方案1、技術(shù)方案環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增〔LAMP〕和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)常見(jiàn)病原菌方法的建立①常見(jiàn)病原菌特異性LAMP引物的設(shè)計(jì)。依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)DNALAMP專用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性LAMP引物〔包括每類致病菌的兩個(gè)外引物、兩個(gè)內(nèi)引物和的序列，以保證靶序列的特異性擴(kuò)增〕DNADNADNA。③LAMP擴(kuò)增反響體系的優(yōu)化：對(duì)引物濃度、內(nèi)引物和外引物dNTPBstDNAMg2+濃度等條件進(jìn)展優(yōu)化。55-65℃之間優(yōu)化等溫?cái)U(kuò)增溫度。⑤擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：建立快速顯色法和電泳分析法兩種檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。⑥以上述爭(zhēng)論結(jié)果為根底，建立常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)。常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的靈敏度分析將常見(jiàn)病原菌目標(biāo)基因克隆至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)105、104、103、102、101，以其為模板做環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反響，檢測(cè)本方法的靈敏度。常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的特異性分析分別以病原菌和非病原菌基因組DNA為模板做環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反響，檢測(cè)本方法的特異性。常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)PCR以LAMPPCR擴(kuò)增，并與LAMP的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)展比較分析，進(jìn)一步推斷LAMP技術(shù)的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法在食品檢測(cè)和臨床診斷中的應(yīng)用爭(zhēng)論將本方法應(yīng)用于食品檢測(cè)和臨床診斷中，分析本方法對(duì)不同樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確率。病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒的研制依據(jù)本工程所建立的LAMPLAMP〔包括單一病原菌檢測(cè)試劑盒和多種病原菌同時(shí)檢測(cè)試劑盒。2、工藝流程樣品收集樣品收集基因序列分析核酸提取引物設(shè)計(jì)引物優(yōu)化、組合LAMP反響體系的建立反響條件優(yōu)化特異性試驗(yàn)靈敏度試驗(yàn)陽(yáng)性比照陰性比照LAMP方法應(yīng)用于病原體檢測(cè)國(guó)標(biāo)法比較試驗(yàn)同類產(chǎn)品比較試驗(yàn)試劑盒中試〔三〕工程技術(shù)質(zhì)量指標(biāo)95%。本工程建立的方法對(duì)病原菌目的基因檢測(cè)的靈敏度到達(dá)101本工程建立的方法不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。30-60560鐘內(nèi)完成?！菜摹彻こ虉?zhí)行過(guò)程中各階段目標(biāo)2007第一季度：設(shè)計(jì)引物，引物合成，購(gòu)置試驗(yàn)菌株和有關(guān)試劑，完善試驗(yàn)條件。DNA第三季度：等溫?cái)U(kuò)增反響體系優(yōu)化，溫育條件優(yōu)化。第四季度：擴(kuò)增反響產(chǎn)物檢測(cè)方法的建立〔快速顯色法、電泳分析法。2008第一季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法操作程序確定，多重等溫?cái)U(kuò)增同時(shí)檢測(cè)多種病原菌試驗(yàn)技術(shù)建立。其次季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法的準(zhǔn)確度分析。第三季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法的靈敏度分析。第四季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方PCR2009第一季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法在食品和臨床標(biāo)本上的應(yīng)用及效果分析。其次季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌試劑盒和多重等溫?cái)U(kuò)增試劑盒研制。第三季度：試劑盒的應(yīng)用及技術(shù)推廣。第四季度：課題總結(jié)，鑒定。〔五〕工程經(jīng)費(fèi)預(yù)算狀況本工程申請(qǐng)科研經(jīng)費(fèi)5萬(wàn)元。其中設(shè)備、儀器購(gòu)置費(fèi)1萬(wàn)元；0.50.50.520.5三、工程實(shí)施支撐條件1、工程技術(shù)來(lái)源本工程的技術(shù)由工程申請(qǐng)人建立。2、工程試驗(yàn)、檢測(cè)條件工程申請(qǐng)人所在學(xué)院—生命科學(xué)學(xué)院擁有食品科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)建試驗(yàn)室。這些重點(diǎn)學(xué)科和重點(diǎn)試驗(yàn)室設(shè)施完善、先進(jìn)，具有進(jìn)展本工程爭(zhēng)論的試驗(yàn)條件和試驗(yàn)場(chǎng)地，為本工程的完成供給了保障。工程申請(qǐng)人所在的江西省生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件先進(jìn)，具有PE-9700型PCR儀，全自動(dòng)DNA測(cè)序儀〔ABIPrism3100、高速冷凍離心機(jī)、超速冷凍離心機(jī)、超低溫冰箱、Milli-Q超純水系統(tǒng)、各種規(guī)格的電泳儀、紫外分光光度計(jì)、設(shè)施先工作。工程申請(qǐng)人長(zhǎng)期從事分子生物學(xué)爭(zhēng)論工作，嫻熟把握了分子生的順當(dāng)完成奠定了技術(shù)根底。3、工程申請(qǐng)單位人才資源狀況“211”工程重點(diǎn)建設(shè)大學(xué)，人才資源豐富，科研力氣雄厚。生命科學(xué)學(xué)院有專任15060282:1。4、工程組人員專業(yè)構(gòu)造、職稱構(gòu)造工程組科研人員7人，主要由生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)、微22325、工程增投資籌集狀況5四、工程預(yù)期經(jīng)濟(jì)效益1、預(yù)期市場(chǎng)需求病原菌的檢測(cè)是食品檢測(cè)和臨床診斷中的常規(guī)工程，食品檢測(cè)檢測(cè)工作中有很大潛力。然而，目前國(guó)外僅有將其用于病毒DNA和RNA檢測(cè)的爭(zhēng)論報(bào)道，在病原菌檢測(cè)領(lǐng)域尚無(wú)以此技術(shù)開(kāi)發(fā)的商業(yè)試劑，國(guó)內(nèi)也未見(jiàn)這方面的爭(zhēng)論開(kāi)發(fā)報(bào)道。因此，開(kāi)發(fā)病原菌的環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增試劑具有寬闊的前景。2、預(yù)期盈利水平508元，假設(shè)以201250萬(wàn)個(gè)樣品的試劑，每年獲利600產(chǎn)生明顯的經(jīng)濟(jì)效益。3、預(yù)期產(chǎn)業(yè)化前景本工程是針對(duì)嚴(yán)峻影響人類安康的病原菌的檢測(cè)問(wèn)題提出的，子生物學(xué)技術(shù)，產(chǎn)品的科技含量高，生產(chǎn)本錢(qián)低，利潤(rùn)空間大。本的試劑生產(chǎn)企業(yè)經(jīng)技術(shù)培訓(xùn)后可生產(chǎn)本產(chǎn)品。4、工程實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)分析課題組已開(kāi)展了本工程的前期爭(zhēng)論工作，目前正在進(jìn)展嗜水單科研平臺(tái)建設(shè)工作。因此，本工程的實(shí)施根本上不存在技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。常規(guī)檢測(cè)病原菌的細(xì)菌培育分別鑒定法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，近年進(jìn)展起來(lái)的PCR鑒定法易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。PCR準(zhǔn)確、靈敏、低本錢(qián)等優(yōu)點(diǎn)。在本工程的爭(zhēng)論中，我們還將建立一次全能夠取代目前使用的常規(guī)分析方法和PCR方法，成為病原菌檢測(cè)五、工程估量社會(huì)效益、環(huán)境效益1、