中國(guó)海洋大學(xué)分子生物學(xué) 復(fù)習(xí)資料

DasallesistDeutschland~2010DasallesistDeutschland~2010分子牛物學(xué)第第#頁(yè)共19頁(yè)至其結(jié)合位點(diǎn)。第6章基因表達(dá)調(diào)控主要內(nèi)容：第一節(jié)基因表達(dá)調(diào)控概論第二節(jié)原核基因表達(dá)調(diào)控第三節(jié)真核基因表達(dá)調(diào)控基因組(genome)：一個(gè)細(xì)胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整套基因。正調(diào)控：新加入的調(diào)節(jié)蛋白開啟結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。負(fù)調(diào)控：新加入的調(diào)節(jié)蛋白關(guān)閉結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。負(fù)調(diào)控系統(tǒng)：調(diào)節(jié)蛋白一阻遏蛋白基因表達(dá)㈩一調(diào)節(jié)蛋白一基因表達(dá)關(guān)閉㈠正控制系統(tǒng)：調(diào)節(jié)蛋白一誘導(dǎo)蛋白基因關(guān)閉㈠丁調(diào)節(jié)蛋白一基因表達(dá)開啟㈩誘導(dǎo)型操縱子與阻遏型操縱子誘導(dǎo)物與誘導(dǎo)：在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中能開啟或促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的小分子化合物叫做誘導(dǎo)物。只有在小分子誘導(dǎo)物存在時(shí)誘導(dǎo)型操縱子(inducibleoperon)才能發(fā)揮作用。阻遏物與阻遏：產(chǎn)生阻遏作用的小分子物質(zhì)為阻遏物，也稱為輔阻遏物。阻遏型操縱子(repressibleoperon)只有在小分子阻遏物不存在時(shí)才能發(fā)揮作用，加入小分子阻遏物則關(guān)閉基因的轉(zhuǎn)錄。四種調(diào)控類型(負(fù)調(diào)控針對(duì)阻遏蛋白，正調(diào)控針對(duì)激活蛋白，阻遏后基因不轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)后基因轉(zhuǎn)錄)可誘導(dǎo)負(fù)調(diào)控一一阻遏蛋白有活性，基因不轉(zhuǎn)錄；阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合失活，基因轉(zhuǎn)錄?？勺瓒糌?fù)調(diào)控一一阻遏蛋白無活性，基因轉(zhuǎn)錄；阻遏蛋白與輔阻遏物結(jié)合，基因不轉(zhuǎn)錄?？烧T導(dǎo)正調(diào)控一一激活蛋白無活性，基因不轉(zhuǎn)錄；激活蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合激活，基因轉(zhuǎn)錄?？勺瓒粽{(diào)控一一激活蛋白有活性，基因轉(zhuǎn)錄；激活蛋白與輔阻遏物結(jié)合，基因不轉(zhuǎn)錄。管家基因(house-keepinggene)：某些基因在一個(gè)生物體幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，其產(chǎn)物在細(xì)胞里總是存在的，通常被稱為管家基因。順式作用元件(cis-actiongelement)：是指可影響自身基因表達(dá)活性的特異DNA序列。通常是非編碼序列。包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及沉默子等。反式作用因子(trans-actiongelement)：絕大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達(dá)后，通過與特異的順式作用元件相互作用，影響另一基因的轉(zhuǎn)錄，稱為反式作用因子。原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特點(diǎn)：操縱子模型具有普遍性阻遏蛋白與阻遏機(jī)制具有普遍性b因子決定RNA聚合酶識(shí)別特異性乳糖操縱子及應(yīng)用基因Z：卩-半乳糖苷酶基因，分解乳糖為半乳糖和葡萄糖；基因Y：乳糖透性酶基因，增加細(xì)胞壁透性，有助于乳糖進(jìn)入基因A：半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，催化乙?；鶑囊阴］o酶A操縱基因0：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位置，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏物附著處；m=iw和代IM勒剛赳■時(shí)尤悟性醐別由釣ffT-4①NliH恬性皿滯曲肛過諛燼■:-如■和即対旳調(diào)控區(qū)搽姒洋列啟動(dòng)序列結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子P：RNA聚合酶聚集的地方；CAP位點(diǎn)：激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)，激活蛋白通過cAMP對(duì)葡萄糖作出反應(yīng)；調(diào)節(jié)基因I：編碼阻遏蛋白或激活蛋白。Lac負(fù)調(diào)控模型：乳糖缺乏時(shí)，阻遏物封閉操縱序列，RNA聚合酶不能達(dá)到轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄停止；當(dāng)培養(yǎng)基中有誘導(dǎo)物一一乳糖時(shí)，乳糖進(jìn)入細(xì)胞中，與阻遏物結(jié)合并使其失活，阻遏物脫離操縱子；RNA聚合酶達(dá)到轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄過程開始，并翻譯生成與乳糖代謝有關(guān)的3種酶。乳糖操縱子的正調(diào)控：Lac操縱子既受到其阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控，也受CAP的正調(diào)控；CAP是一類正調(diào)控因子，結(jié)合于很多啟動(dòng)子，是控制營(yíng)養(yǎng)代謝有關(guān)的操縱子的激活蛋白；CAP活化有賴于第二信使分子環(huán)磷腺苷(cAMP);CAP蛋白與cAMP形成復(fù)合物后才能結(jié)合于CAP結(jié)合位點(diǎn)激活Lac操縱子。葡萄糖的降解與cAMP含量有關(guān)。CAP結(jié)合位點(diǎn)E.coli的乳糖啟動(dòng)子有兩個(gè)CAP結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)在-70至到-50(位點(diǎn)I),另一個(gè)在-50至U-40(位點(diǎn)II)；位點(diǎn)I是具有強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)特征的反向重復(fù)序列；當(dāng)cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合于位點(diǎn)I，位點(diǎn)II結(jié)合復(fù)合物的能力顯著提高；CAP結(jié)合與Lac轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)系CAP-cAMP復(fù)合物與啟動(dòng)子上CAP位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)了RNA聚合酶對(duì)-35和-10序列的識(shí)別和結(jié)合，并形成開放起始復(fù)合物，提高了轉(zhuǎn)錄效率。cAMP-CRP復(fù)合物與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是lacmRNA合成起始所必需的，因?yàn)檫@個(gè)復(fù)合物結(jié)合于啟動(dòng)子上游，能使DNA雙螺旋發(fā)生彎曲，有利于形成穩(wěn)定的開放型啟動(dòng)子-RNA聚合酶結(jié)構(gòu)。阻遏物則是一個(gè)抗解鏈蛋白，阻止形成開放結(jié)構(gòu)，從而抑制RNA聚合酶的功能。色氨酸操縱子Trp操縱子可阻遏負(fù)調(diào)控系統(tǒng)一一粗調(diào)控色氨酸操縱子的衰減子調(diào)控一一細(xì)調(diào)控衰減子真核基因表達(dá)7個(gè)可控點(diǎn)染色體和染色質(zhì)水平的活化轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，包括基因的開閉，轉(zhuǎn)錄活性水平的高低。RNA加工水平上的調(diào)控，對(duì)初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活化、修飾、選擇性剪接等。轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)物，如mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程受到的控制。翻譯的控制，選擇哪種mRNA給核糖體翻譯，包括翻譯量的控制。蛋白合成后選擇性地被激活或失活，蛋白質(zhì)水平上的剪切、活性水平的控制。控制mRNA的選擇性降解是基因表達(dá)調(diào)控的另一重要方面?；騺G失：原生動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、昆蟲和甲殼綱某些動(dòng)物細(xì)胞分化時(shí)，將丟失染色體的某些DNA片段而永久性消除基因活性?；驍U(kuò)增：某些基因拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象，其目的在于使細(xì)胞在短期內(nèi)產(chǎn)生大量基因產(chǎn)物以滿足生長(zhǎng)發(fā)育需要。染色體重排：基因重排是一個(gè)基因從遠(yuǎn)離其啟動(dòng)子的地方移到距離較近的地方而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；基因重排顯示出基因的多樣性，顯示出基因組與mRNA復(fù)雜性之間沒有線性關(guān)系。高敏感性位點(diǎn)(preferentialsensitivity)：一般位于基因上游1kbp范圍內(nèi)，長(zhǎng)度限于100~200bp，是轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)蛋白質(zhì)因子與啟動(dòng)子識(shí)別、結(jié)合的序列；該位點(diǎn)序列可與其它蛋白質(zhì)結(jié)合，阻止組蛋白的結(jié)合，從而不形成通常的核小體結(jié)構(gòu)；高敏感點(diǎn)與基因表達(dá)有關(guān)，高敏感性的出現(xiàn)意味著基因更接近可轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。超敏感位點(diǎn)(hypersensitivesites)：超敏感位點(diǎn)與整個(gè)基因簇的活化有關(guān)，而高敏感位點(diǎn)僅僅同基因簇中某個(gè)基因活化轉(zhuǎn)錄相關(guān)；高敏感位點(diǎn)緊靠活化基因，主要在啟動(dòng)子范圍內(nèi)；而超敏感位點(diǎn)遠(yuǎn)離基因，而且5‘和3'端成對(duì)出現(xiàn)，在超敏感性位點(diǎn)的界限之內(nèi)是潛在的可活化基因。核小體置換：轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與組蛋白在啟動(dòng)子區(qū)域存在相互排斥、置換現(xiàn)象。核小體置換方式：持久性置換、誘導(dǎo)性置換、混合類型。甲基化不足：甲基化與基因活性調(diào)節(jié)有關(guān)：甲基化程度高，基因轉(zhuǎn)錄活性低；而甲基化程度低，基因轉(zhuǎn)錄活性高。因此活躍基因狀態(tài)稱做甲基化不足(under-methylation)。CpG島：基因組中穩(wěn)定成簇的非甲基化GC小片段。增強(qiáng)子：具有正調(diào)控功能的順式作用元件，能明顯增加與其連鎖基因轉(zhuǎn)錄頻率；沉默子：為負(fù)調(diào)控元件。在真核細(xì)胞中數(shù)量遠(yuǎn)少于增強(qiáng)子。沉默子的DNA序列被調(diào)控蛋白結(jié)合后阻斷了轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成或活化，使基因表達(dá)活性關(guān)閉。26.DNA蛋白檢測(cè)和純化>凝膠滯留法>DNA酶足跡法>親和層析分離純化DNA結(jié)合蛋白27.miRNA與siRNARNAi的機(jī)制：⑴double-strandedRNA(dsRNA)intocertainorganismsandcelltypes.⑵Inthecell,longdsRNAsarecleaved(劈開)intoshort21-25exogenousviEiIranspcsan

dsRNAdsHNAdsRNA?RMAs^rthessnucleotidesmallinterferingRNAs,orsiRNAs,byaribonuclease(核糖核酸酶)knownasDicer(step2)帽子.ThesiRNAssubsequentlyassemblewithproteincomponentsintoanRNA-inducedsilencingcomplex(RISC).AnATP-generatedunwindingofthesiRNAactivatestheRISC(step3).RISCinturnbindstothehomologoustranscriptbybasepairinginteractions(堿基互補(bǔ)配對(duì)原則)andcleavesthemRNA(step4).⑸ThissequencespecificdegradationofmRNA(step5)resultsingenesilencing.RNAinterference(RNAi)isaphenomenoninwhichtheintroductionofdouble-strandedRNA(dsRNA)intocertainorganismsandcelltypescausesdegradation(降解)ofthehomologous(類似的)mRNA.siRMAd腳|射RdHF|byEKtafiucleafie_一__L'HccndarysiRNAsb)'DICERdegradedRNAbyeoudeases相同點(diǎn)/聯(lián)系點(diǎn)siRNAmiRNA長(zhǎng)度及特征都約在22nt左右，5'端是磷酸基，3’端是羥基合成的底物miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的Dicer酶依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)Argonaute家族蛋白都需要Argonaute家族蛋白參與RISC組分二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有重疊；產(chǎn)生了ontarget和offtarget的問題作用方式都可以阻遏靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致mRNA降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用進(jìn)化關(guān)系可能的兩種推論：siRNA是miRNA的補(bǔ)充，miRNA在進(jìn)化過程中替代了siRNA不同點(diǎn)/分歧點(diǎn)siRNAmiRNA機(jī)制性質(zhì)往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后誘導(dǎo)而產(chǎn)生，屬于異常情況是生物體自身的一套正常的調(diào)控機(jī)制直接來源長(zhǎng)鏈dsRNA發(fā)夾狀pre-miRNA分子結(jié)構(gòu)siRNA是雙鏈RNA，3‘端有2個(gè)非配對(duì)堿基，通常為UUmiRNA是單鏈RNA對(duì)靶RNA特異性較高，一個(gè)突變?nèi)菀滓餜NAi沉默效應(yīng)的改變相對(duì)較低，一個(gè)突變不影響miRNA的效應(yīng)作用方式RNAi途徑miRNA途徑生物合成，成熟過程由dsDNA在Dicer酶切割下產(chǎn)生;發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中pri-miRNA在核內(nèi)由一種稱為Drosha酶處理后成為60nt的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNAs；這些pre-miRNAs在轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核外之后再由Dicer酶進(jìn)行處理，酶切后成為成熟的miRNAs；發(fā)生在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中互補(bǔ)性一般要求完全互補(bǔ)不完全互補(bǔ)，存在錯(cuò)配現(xiàn)象RISCs的分子量不同siRISCsmiRISCs/miRNP各自的生物學(xué)功能不同i抵抗病毒的防御機(jī)制(Pfefferetal.,2004;Dingetal.,2004)；ii沉默那些過分表達(dá)的mRNA；iii保護(hù)基因組免受轉(zhuǎn)座子的破壞。對(duì)有機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用(Rhoadesetal.,2002)重要特性高度特異性咼度的保守性、時(shí)序性和組織特異性作用機(jī)制單鏈的siRNA結(jié)合到RISC復(fù)合物中，引導(dǎo)復(fù)合物與mRNA完全互補(bǔ)，通過其自身的解旋酶活性，解開siRNAs,通過反義siRNA鏈識(shí)別目的mRNA片段，通過內(nèi)切酶活性切割目的片段，接著再通過細(xì)胞外切酶進(jìn)一步降解目的片段。同時(shí)，siRNA也可以阻遏3’UTR具有短片斷互補(bǔ)的mRNA的翻譯(offtarget)。成熟的miRNAs則是通過與miRNP核蛋白體復(fù)合物結(jié)合，識(shí)別靶mRNA，并與之發(fā)生部分互補(bǔ)，從而阻遏靶mRNA的翻譯。在動(dòng)物中，成熟的單鏈miRNAs與蛋白質(zhì)復(fù)合物miRNP結(jié)合，引導(dǎo)這種復(fù)合物通過部分互補(bǔ)結(jié)合到mRNA的3’UTR(非編碼區(qū)域)，從而阻遏翻譯。除此之外，miRNA也可以切割完全互補(bǔ)的mRNA。加工過程siRNA對(duì)稱地來源于雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂miRNA是不對(duì)稱加工,