基因工程制藥-蘇州培訓(xùn)20170520

基因工程制藥簡介張義浜2017-05-20概述目的基因的獲得基因的表達(dá)基因工程菌的培養(yǎng)基因工程藥物的分離純化傳統(tǒng)制藥（生化制藥）存在的問題:1.材料來源或制造技術(shù)困難而無法研制出產(chǎn)品；

2.從動(dòng)物臟器中提取易感染病毒；

3.存在免疫原性，使用受限制?；蚬こ讨扑幍膬?yōu)點(diǎn)大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)利用基因工程和蛋白質(zhì)工程對(duì)生理活性物質(zhì)進(jìn)行修飾和改造，提高藥效價(jià)值獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的藥物

用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)的，主要是藥用活性蛋白質(zhì)/多肽，包括：（1）免疫相關(guān)蛋白----各種抗原、單克隆抗體。（2）細(xì)胞因子----如IFN、IL、CSF、EGF、VIII、EPO（3）激素----胰島素、生長激素、心鈉素、人腦激素、人松馳激素。（4）酶類----尿激酶、鏈激酶、葡聚糖酶、組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑、SOD、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑。早期部分基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時(shí)間產(chǎn)品研制國家用途上市國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗1983美國乙肝1986歐洲人白細(xì)胞介素（IL）1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國我國批準(zhǔn)上市的部分生物技術(shù)藥物批準(zhǔn)年份藥品批準(zhǔn)年份藥品1989IFN-α1b1999125AlaIL-2、人胰島素、Anti-CD3鼠源單抗1992IFN-α2a2000人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表皮生長因子（EGF）、EGF衍生物霍亂疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）2001抗IL-8鼠源單抗凝乳劑1995乙肝疫苗（酵母）2003IL-11、腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核嵌合抗體注射液重組葡激酶（r-SAK）1996IFN-α2b，乙肝疫苗（CHO）粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）2004重組人p53腺病毒注射液抗EGFR人源單抗1997粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）重組鏈激酶（γ-SK）、EPO2005重組人腦利鈉肽、重組人血管內(nèi)皮抑素重組人5型腺病毒注射液（H101）、rhTNF-α、rhTPO1998IFN-γ、125SerIL-2、生長激素（GH）痢疾疫苗、牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）2006重組TNFR-Fc融合蛋白

什么是基因工程技術(shù)？ 基因工程（geneticengineering）：也稱基因操作、遺傳工程，重組體DNA技術(shù)，基因克隆或分子克隆，指將不同生物的遺傳物質(zhì)——基因，在體外進(jìn)行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒等）轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使所需要的基因在細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)物或組建成新的生物類型。制備基因工程藥物的基本過程

獲得目的基因

↓

構(gòu)建重組質(zhì)粒

↓

組建基因工程菌(或細(xì)胞)

↓

培養(yǎng)工程菌

↓

產(chǎn)物分離純化

↓

除菌過濾

↓

半成品檢定

↓

成品檢定

↓

包裝上游階段選擇表達(dá)系統(tǒng)主要考慮：必須保證所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有生物活性考慮基因工程蛋白質(zhì)表達(dá)量的多少蛋白質(zhì)分離純化的難易程度下游階段基因的克隆工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基目的基因的獲得一、反轉(zhuǎn)錄法二、反轉(zhuǎn)錄PCR三、化學(xué)合成法常用的方法:一、反轉(zhuǎn)錄法為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的DNA序列，可以從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA,以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄生成該蛋白質(zhì)mRNA互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列。cDNA克隆示意圖DNA聚合酶ImRNA

反轉(zhuǎn)錄酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1二、反轉(zhuǎn)錄PCR

提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，直接以其為模板（不需要合成cDNA第二鏈）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因，用于重組、克隆。三、化學(xué)合成法前提：核苷酸序列已知；或已知其蛋白質(zhì)的氨基酸序列，再推導(dǎo)出核苷酸序列限制性：

1）不能直接合成太長的基因；

2）遺傳密碼的簡并性可導(dǎo)致中性突變；

3）成本較高DNA合成儀基因的克隆與表達(dá)基因表達(dá)：基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯及所有加工過程?；蚋咝П磉_(dá)：外源基因在某種宿主細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下一個(gè)外源基因片段，重組到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物?；虮磉_(dá)研究的主要問題：目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。建立最佳的基因表達(dá)體系，是基因表達(dá)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵一、宿主菌的選擇宿主菌應(yīng)滿足以下要求：具有高濃度、高產(chǎn)量、高產(chǎn)率；能利用易得廉價(jià)原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；容易進(jìn)行代謝調(diào)控；方便重組DNA操作；產(chǎn)物容易提取純化。1.原核細(xì)胞（1）大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的形式：細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)(包涵體)、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，極少數(shù)情況下也可分泌到細(xì)胞外。不同的表達(dá)形式具有不同的表達(dá)水平及完全不同的雜質(zhì)。大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，遺傳背景清楚（共4405

ORF）基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物缺陷缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素（2）枯草芽孢桿菌分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包涵體；不能使蛋白質(zhì)糖基化，另外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解（3）鏈霉菌重要的工業(yè)微生物。不致病、使用安全，分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有一定的糖基化能力2、真核細(xì)胞（1）酵母特點(diǎn)：真核生物細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物能糖基化；基因組小，僅為大腸桿菌的4倍；世代時(shí)間短，繁殖迅速；基因操作與原核生物相似；建立了有分泌功能的表達(dá)系統(tǒng)，將產(chǎn)物分泌出胞外，分離純化工藝相對(duì)簡單。（2）絲狀真菌特點(diǎn)：有很強(qiáng)的蛋白分泌能力；能正確進(jìn)行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化等;其糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如曲霉等）等被確認(rèn)是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。真核生物和原核生物基因表達(dá)過程示意圖克隆載體:克隆了外源DNA后，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，使克隆的DNA片段數(shù)量大大增加表達(dá)載體:將外源基因或DNA片段在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)插入型載體:將外源基因或DNA插入其中置換型載體:切除載體部分DNA，代之以外源基因或DNA。載體（vector）質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主細(xì)胞染色體外而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。絕大多數(shù)質(zhì)粒是DNA型的，天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA。基因克隆的載體質(zhì)粒DNA分子都具有復(fù)制子、選擇性標(biāo)記、克隆位點(diǎn)。原核細(xì)胞表達(dá)載體非融合型pKK223-3分泌型PINⅢ-ompA1

融合蛋白表達(dá)載體pGEX結(jié)構(gòu)包涵體型pBV220結(jié)構(gòu)

融合蛋白表達(dá)載體非融合型表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體包涵體型表達(dá)載體（一）表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件：載體能夠獨(dú)立的復(fù)制；具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記,且克隆位點(diǎn)應(yīng)在啟動(dòng)子序列后，以便外源基因表達(dá)；具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶識(shí)別；具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；具有很強(qiáng)的終止子，使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄無關(guān)的基因；所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。（二）影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素外源基因的劑量外源基因的表達(dá)效率：

A、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱：將目的基因插入大腸桿菌RNA聚合酶能識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子下游

B、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性

C、SD序列和起始密碼的間距

D、密碼子組成：設(shè)計(jì)引物或合成基因時(shí)選擇大腸桿菌“偏愛”的密碼子表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：

A、組建融合蛋白；

B、利用信號(hào)肽將真核基因產(chǎn)物搬至周質(zhì)空隙中；

C、位點(diǎn)特異性突變，增加蛋白的穩(wěn)定性；

D、采用蛋白酶缺陷型大腸桿菌，減弱降解作用細(xì)胞的代謝負(fù)荷：

A、宿主細(xì)胞的生長與外源基因的表達(dá)分開；

B、宿主細(xì)胞的生長與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開；

C、形成不溶性的包涵體工程菌的培養(yǎng)條件（三）真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的形式1.以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起，稱融合蛋白。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，不易被細(xì)菌酶類降解；易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；缺點(diǎn)：有免疫原性，需切除原核多肽2.以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性；缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞；可能引起人體免疫反應(yīng)3.分泌型表達(dá)蛋白藥物基因?qū)⑼庠椿蛉诤系骄幋a信號(hào)肽序列的下游。常用的信號(hào)肽有：堿性磷酸酶信號(hào)肽；膜外周質(zhì)蛋白信號(hào)肽；霍亂弧菌毒素B亞單位；優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含甲硫氨酸殘基；缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號(hào)肽不被切割或不在特定位置上切割。酵母中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體1.載體的復(fù)制序列（1）YEp類（酵母附加體質(zhì)粒）（2）YRp類（酵母復(fù)制型質(zhì)粒）（3）YCp類（酵母著絲粒質(zhì)粒）（4）YIp類（酵母整合型質(zhì)粒）2.克隆載體向酵母載體中引入大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分，這樣構(gòu)成的克隆載體同時(shí)帶有細(xì)菌和酵母的復(fù)制原點(diǎn)和選擇標(biāo)記。酵母常用的選擇性標(biāo)記：氨基酸或核苷酸合成酶系基因，對(duì)抑制酵母生長的藥物具有抵抗力的抗性基因3.表達(dá)載體普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對(duì)其N末端氨基酸是否增減并無嚴(yán)格要求。精確表達(dá)載體：要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素1.外源基因的劑量：質(zhì)?？截悢?shù)及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性2.外源基因的表達(dá)效率：

A、啟動(dòng)子

B、分泌信號(hào)的效率

C、終止序列的影響3.外源蛋白的糖基化4.宿主菌株的影響：

A、菌體生長力強(qiáng)；

B、菌體內(nèi)源蛋白酶要弱；

C、菌株性能穩(wěn)定；

D、分泌能力強(qiáng)基因工程菌的培養(yǎng)基因工程菌發(fā)酵的基本操作方式有：

分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限

半連續(xù)培養(yǎng)（補(bǔ)料分批）在一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營養(yǎng)，使細(xì)胞進(jìn)一步的生長，或得到更多的代謝產(chǎn)物連續(xù)培養(yǎng)不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。連續(xù)培養(yǎng)則多用于動(dòng)力學(xué)特性和穩(wěn)定性等研究。

透析培養(yǎng)

固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)方式補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的培養(yǎng)方法。在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對(duì)數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補(bǔ)料措施結(jié)合起來，根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補(bǔ)料的流加速率。連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到一定程度后，開動(dòng)進(jìn)料和出料蠕動(dòng)泵，以一定稀釋率進(jìn)行不間斷培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)可以為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長速率，為研究基因工程菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、生理生化特性、環(huán)境因素對(duì)基因表達(dá)的影響等創(chuàng)造了良好的條件。

但由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達(dá)階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。在這樣的系統(tǒng)中關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率和細(xì)胞比生長速率。優(yōu)化這三個(gè)參數(shù)以保證在第一階段培養(yǎng)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定，菌體進(jìn)入第二階段后可獲得最高表達(dá)水平或最大產(chǎn)率。透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響。采用膜透析裝置是在發(fā)酵過程中用蠕動(dòng)泵將發(fā)酵液抽出打入罐外的膜透析器的一側(cè)循環(huán)，其另一側(cè)通入透析液循環(huán)，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，大量乙酸在透析器中透過半透膜，降低培養(yǎng)基中的乙酸濃度，并可通過在透析液中補(bǔ)充養(yǎng)分而維持較合適的基質(zhì)濃度，從而獲得高密度菌體。膜的種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液的比例，透析液的組成，循環(huán)流速，開始透析的時(shí)間和透析培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間段都對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)率有影響固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對(duì)分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點(diǎn)，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展?；蚬こ叹l(fā)酵中試

基因工程菌中試應(yīng)考慮的問題：適宜商品化生產(chǎn)的工程菌，設(shè)計(jì)發(fā)酵反應(yīng)器，選擇反應(yīng)過程，發(fā)酵培養(yǎng)基組分，維持生產(chǎn)工藝最佳化的方法，工藝監(jiān)測方法，工藝控制方法，工藝自動(dòng)化使用方法，生物催化劑使用，產(chǎn)品提取方法的選擇，分離精制技術(shù)的選擇?；蚬こ叹牟环€(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，兩種表現(xiàn)形式：

1）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失

2）分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸基因工程菌不穩(wěn)定性的可能產(chǎn)生機(jī)制：受體細(xì)胞中限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常生長代謝

能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解程序重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排培養(yǎng)基比生長速率限制性基質(zhì)溫度pH和溶氧外源基因表達(dá)遺傳特性

影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素載體的選擇宿主的選擇外源基因整合到宿主染色體上發(fā)酵工藝1.培養(yǎng)基一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性微生物在含有有機(jī)氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，由于培養(yǎng)基提供了生長必須的氨基酸和其他物質(zhì)，微生物的生長較基本培養(yǎng)基快。

培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響2.比生長速率基因重組菌的比生長速率對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大影響。提高比生長速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性?；蛑亟M菌的比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，如溫度，pH，溶氧，限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度，有害代謝產(chǎn)物濃度等。在一定的溫度和pH下，限制性基質(zhì)濃度往往是決定比生長速率的主要因素。3.限制性基質(zhì)一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，微生物的生長通常會(huì)受到一種或幾種物質(zhì)的限制。限制性基質(zhì)的種類對(duì)重組菌有不同的影響4.pH和溶解氧pH和溶氧是影響微生物生長的重要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌時(shí)，通常都需要維持一定的pH和溶氧水平。在基因重組菌的高密度培養(yǎng)時(shí)，為了維持所需的溶氧水平，除了提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，往往還要在通入的空氣中補(bǔ)充氧氣，以提高發(fā)酵罐的供氧能力。5.外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá)會(huì)引