番茄組織培養(yǎng)與再生體系的優(yōu)化

番茄組織培養(yǎng)與再生體系的優(yōu)化

番茄是番茄科的一種一級或二級植物。作為一種全球蔬菜，它在擴(kuò)大了互補(bǔ)物質(zhì)資源方面取得了巨大成功。另一方面，它是一種廣泛種植，另一方面，它在遺傳理論上進(jìn)行了深入的研究，為補(bǔ)充互補(bǔ)物質(zhì)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。近年來,隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,外源基因轉(zhuǎn)入番茄的研究也越來越多,這不僅使人們獲得了農(nóng)藝性狀改良的番茄新品種(如抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆、果實(shí)的延熟保鮮等),而且利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)還可使番茄作為生產(chǎn)食用疫苗的生物反應(yīng)器.當(dāng)前,在植物基因工程技術(shù)中,多數(shù)成功的轉(zhuǎn)化體系都是建立在良好的組織培養(yǎng)系統(tǒng)基礎(chǔ)之上的.自人類首次利用根誘導(dǎo)培養(yǎng)出的愈傷組織獲得再生植株以來,國內(nèi)外研究者們又相繼從各個(gè)不同角度對番茄的組織培養(yǎng)體系進(jìn)行了研究,但這些報(bào)道中,有的培養(yǎng)周期長,有的培養(yǎng)基復(fù)雜,有的外植體取材受季節(jié)限制等等.如將這些培養(yǎng)方案用于番茄的遺傳轉(zhuǎn)化,就會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率和結(jié)果.筆者就幾種影響番茄組織培養(yǎng)體系建立的重要因素如供體基因型、激素濃度、培養(yǎng)條件等作了初步研究,建立了一套優(yōu)化的番茄組織培養(yǎng)與再生體系,為下一步進(jìn)行番茄的遺傳轉(zhuǎn)化打下了良好的基礎(chǔ).1材料和方法1.1外植體的選擇番茄品種選用購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜花卉研究所的毛粉802、串株櫻桃番茄、美麗櫻桃番茄、黃梨櫻桃番茄、紅梨櫻桃番茄、中雜9號、中蔬6號、麗春番茄、中雜8號、中蔬4號、中蔬5號共11個(gè)品種的子葉、下胚軸段、葉片、莖段做為外植體.1.2培養(yǎng)基產(chǎn)品1.2.1,5-ba1的添加量P1:MS+IAA0.2mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;P2:MS+IAA0.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-11.2.2l-1+6-ba1.0.0.2P3:MS+IAA0.02mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;P4:MS+IAA0.05mg·L-1+6-BA1.0mg·L-11.2.3生根培養(yǎng)基1/2MS+蔗糖3%+瓊脂0.7%+IBA1.0mg·L-1.1.3培訓(xùn)條件25℃,暗培養(yǎng)箱誘導(dǎo)出愈傷組織后轉(zhuǎn)入光照14h,溫度(25±2)℃誘導(dǎo)分化培養(yǎng).1.4誘導(dǎo)愈傷及誘導(dǎo)愈傷將番茄種子用70%酒精浸泡30s,無菌水沖洗1次,再用0.1%升汞溶液浸泡8min,用無菌水沖洗4～5次.接種到1/2MS培養(yǎng)基上,28℃暗培養(yǎng)箱培養(yǎng),發(fā)芽后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)至兩片子葉完全展開.取無菌苗的子葉、下胚軸段、葉片和莖段做外植體,外植體大小0.6cm左右,接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上.25℃,部分材料置于暗培養(yǎng)箱誘導(dǎo)愈傷,部分置于光下誘導(dǎo)愈傷,比較其影響,愈傷產(chǎn)生后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上并接受14小時(shí)/天的光照,分化培養(yǎng)出的苗長到1.5cm后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中,生成發(fā)達(dá)根系后,揭開培養(yǎng)膜往三角瓶中倒入少許水接受煉苗,3～5d后洗去苗根部的培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入土壤中成為正常植株,并能開花結(jié)果.2結(jié)果2.1培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化IAA和6-BA是目前在番茄組織培養(yǎng)中常用的兩種激素.其濃度配比對11種番茄外植體的愈傷組織的形成及分化的影響見表1,從表中可以看出,11種番茄子葉、下胚軸段、葉片、莖段對植物激素的要求存在一定的差別,11個(gè)品種的外植體的愈傷誘導(dǎo)率為100%,但當(dāng)6-BA的濃度為1.0mg·L-1時(shí),中蔬9號在P3上,麗春番茄在P4培養(yǎng)基上生長較好,分化率分別為95%,100%.而中蔬5號在P3上、中蔬4號在P4上、紅梨櫻桃番茄在P4培養(yǎng)基上獲得相對較高的分化率,分別為90.9%,83%,84%.從表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出,11個(gè)品種在不同的愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上雖然都以較高的頻率形成愈傷組織,但分化率卻存在很大差別,從36%到100%不等,其中以中9、麗春為最好,而且不同品種在不同培養(yǎng)基上形成的愈傷組織大小及形態(tài)也不盡相同,在IAA濃度較高的培養(yǎng)基上所形成的愈傷組織塊小且有的顏色發(fā)白,有的愈傷組織都長出白色須根.但在轉(zhuǎn)入IAA濃度低的培養(yǎng)基上后,愈傷很快變綠,先出現(xiàn)許多綠點(diǎn),逐漸長大,大約1周左右就有叢生芽分化,且數(shù)量較多.這是因?yàn)樯L素與分裂素比值大時(shí)有利于愈傷的形成,比值小時(shí)有利于細(xì)胞的分化.2.2蔗糖濃度對愈傷組織的誘導(dǎo)分化效果從表2中可以看出在不含蔗糖的培養(yǎng)基上,外植體不能形成愈傷組織,逐漸白化死亡.而在含有不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基上,隨著蔗糖濃度的升高,外植體形成愈傷組織的百分率逐漸升高,在30～50g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基中,愈傷組織形成率均為100%.蔗糖濃度不同時(shí),愈傷組織大小及形態(tài)也不盡相同.蔗糖濃度為10g·L-1時(shí),只在子葉邊緣形成少量的愈傷組織,分化能力也很低,分化率僅為35%.當(dāng)蔗糖濃度升至20～30g·L-1時(shí),外植體邊緣形成較多的白色顆粒狀愈傷組織,并能夠正常分化,但以30g·L-1的蔗糖濃度分化率最高,可達(dá)100%.當(dāng)蔗糖濃度繼續(xù)升高,達(dá)到40～50g·L-1時(shí),雖然都能誘導(dǎo)出愈傷組織,但愈傷組織塊卻明顯變硬且顏色變褐,只有部分愈傷組織能分化,當(dāng)濃度為50g·L-1時(shí),分化率已降至23%.2.3光照培養(yǎng)成因從表3中看出,不經(jīng)過暗培養(yǎng),直接在光照條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),只有部分外植體能形成愈傷組織并且分化率低.如果將外植體暗培養(yǎng)10天,在外植體邊緣開始形成愈傷組織時(shí)進(jìn)行光照培養(yǎng),愈傷組織都可分化.隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的延長,愈傷組織雖可不斷生長,但卻逐漸失去了分化能力.在暗培養(yǎng)30天后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng),只有27%的愈傷組織能分化,很多的則褐化死亡.3討論3.1選擇合適的基因型大量研究證明,基因型是影響番茄組織培養(yǎng)效果的重要因素.在相同培養(yǎng)基上,不同的番茄品種間存在著不同的分化率,只有中蔬9號和麗春番茄在P3、P4培養(yǎng)基上獲得了最高的愈傷組織分化率,而其它幾個(gè)品種雖然在這幾個(gè)培養(yǎng)基上也能形成愈傷組織,并能不同程度的分化,但要獲得最大的分化率和芽再生率,還需進(jìn)一步調(diào)整培養(yǎng)基中的植物激素種類與濃度,因此,選擇合適的基因型在番茄組織培養(yǎng)中尤為重要.3.2不同的植物生長劑用量對番茄外植體再生頻率的影響在植物組織培養(yǎng)中,外源激素的使用是必不可少的,已有許多的研究證明,IAA和6-BA結(jié)合使用會(huì)提高番茄外植體的再生頻率,但由于所選用品種不同,其用量也有很大差別.3.3蔗糖濃度對植物的影響蔗糖作為植物組織培養(yǎng)中的碳源,既可作為營養(yǎng)來源,又可作為滲透調(diào)節(jié)劑.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,選擇合適的蔗糖濃度對植物的組織培養(yǎng)非常重要.蔗糖濃度過低,不能使光合作用有效地進(jìn)行,在愈傷組織中累積的淀粉量不足以使其全部分化,甚至不能分化成苗.而蔗糖濃度過高會(huì)使培養(yǎng)基中的滲透壓過高,對植物材料產(chǎn)生毒害作用,在某種程度上抑制細(xì)胞的分化,進(jìn)而影響分化結(jié)果.3.4暗培養(yǎng)時(shí)間對番茄外植體分化的影響因?yàn)橹参锊牧鲜窃诤堑呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的,所以光照的作用主要是誘導(dǎo)形態(tài)建成.它涉及到植物細(xì)胞分化的若干重要過程.光可能通過光合作用在特殊的細(xì)胞里累積淀粉,并經(jīng)一定量的淀粉聚集,直接或間接地扣動(dòng)了器官發(fā)生的光誘導(dǎo)扳機(jī).暗培養(yǎng)的主要目的是使外植體脫分化,產(chǎn)生一定量的愈傷組織.從表3的結(jié)果可以看出,在完全光照條件下培養(yǎng)番茄外植體只能誘導(dǎo)出少量愈傷組織,因此這些愈傷組織累積的淀粉量也很低,有的甚至無法啟動(dòng)愈傷組織的分化,所以完全光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的分化率很低.而暗培養(yǎng)時(shí)間過長,雖可使愈傷組織大量生長,但由于大部分糖都用于愈傷組織的增殖,即使轉(zhuǎn)入光照條件下,僅通過光合作用在愈傷組織中累積的淀粉也是有限的,只能使很少的愈傷組織能產(chǎn)生芽原基,因此分化率下降.可見