高效液相色譜法測定兔血漿中酮康唑的濃度

高效液相色譜法測定兔血漿中酮康唑的濃度

1固相萃取法差異發(fā)現(xiàn)反映異構(gòu)體的藥物動(dòng)力學(xué)存在顯著差異。酮康唑(Ketoconazole,KTZ)是咪唑類廣譜抗真菌藥,有一對(duì)對(duì)映體,結(jié)構(gòu)如圖1所示。研究表明,酮康唑的左旋對(duì)映體比右旋對(duì)映體的藥理活性高2～4倍。因此,建立血漿中酮康唑?qū)τ丑w濃度的分析方法,進(jìn)行酮康唑?qū)τ丑w藥動(dòng)學(xué)研究,對(duì)確保用藥的安全有效性具有重要意義。酮康唑?qū)τ丑w藥動(dòng)學(xué)的研究目前僅見文獻(xiàn)的報(bào)道。該文獻(xiàn)采用液液萃取法對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理,方法耗時(shí)、有機(jī)溶劑消耗量大,且采用手性固定相法進(jìn)行酮康唑的手性分離,測定成本高。固相萃取法具有溶劑使用量少,操作簡便快速,易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn),符合樣品處理技術(shù)的發(fā)展趨勢,是樣品處理技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Crego等分別用100mgC8以及100mgC18萃取人肝微粒體中的酮康唑,其萃取率僅約為72%和43%,且重現(xiàn)性不佳(RSD為7.4%～15.3%)。開發(fā)新的高效固相萃取介質(zhì)是樣本前處理技術(shù)的重要研究方向。納米材料的高比表面積可以提供數(shù)量巨大的作用位點(diǎn),為高效分離、提取和富集奠定了基礎(chǔ)。其中,納米纖維與其它物質(zhì)有極強(qiáng)的相互滲透力,使其吸脫附性能更加優(yōu)越,用極少量的納米纖維即可很好地富集目標(biāo)物,洗脫溶劑用量亦可大為減少。較之納米纖維裝填小柱,納米纖維膜具有較大的截面積,更有利于提高吸附容量,且傳質(zhì)阻力小,使大體積樣品溶液可以較快速度通過,縮短處理樣品時(shí)間,同時(shí)增大富集倍數(shù),提高檢測方法的靈敏度。因此,基于納米纖維膜的固相萃取是一種極具潛力的樣品前處理方法。本研究以靜電紡絲法制得聚酰胺6納米纖維膜,以其為固相萃取介質(zhì),結(jié)合本課題組建立的高效液相色譜手性流動(dòng)相添加法,測定了兔血漿中的酮康唑?qū)τ丑w的濃度,并對(duì)影響萃取效率的各種因素進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn),建立了家兔血漿中酮康唑?qū)τ丑w的測定方法。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器、試劑和試劑FA1104N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);LC-10ADvp高效液相色譜儀,SPD-10Avp紫外檢測器(日本島津公司);HitachiS-3000N掃描電鏡(日本日立公司);TL-9900色譜工作站(北京泰立公司);800離心機(jī)(常州國華電器有限公司);XW-80A漩渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司);78-1型磁力加熱攪拌器(浙江樂清樂成電器廠);1000μLEppendorf微量移液器。酮康唑外消旋體(西安楊森制藥公司);磺丁基醚-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD,南京師范大學(xué)江蘇省醫(yī)藥超分子材料及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室);NaH2PO4(化學(xué)純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);濃H3PO4(化學(xué)純,南京化學(xué)試劑廠);甲醇和乙腈(色譜純,迪馬公司);聚酰胺6原料(南京德寶生化器材有限公司,分子量為1.6×104);間甲苯酚和甲酸(分析純,上?；瘜W(xué)試劑廠);實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。2.2酮康唑外消旋體貯備液準(zhǔn)確稱取適量酮康唑外消旋體,用甲醇溶解并配制10.00g/L酮康唑外消旋體貯備液,4ue84aSymbolpB@C保存。儲(chǔ)備液以流動(dòng)相稀釋,得到濃度為0.5,1.0,2.0,2.5,3.0和4.0mg/L的酮康唑外消旋體標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.3磺丁基--環(huán)糊精的檢測DiamondC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(0.02mol/LNaH2PO4)=60∶40(含0.02%三乙胺(w/V)和1.0mmol/L磺丁基-β-環(huán)糊精,用稀H3PO4調(diào)至pH3.0);流速:1.00mL/min;檢測波長:230nm;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:30ue84aSymbolpB@C。2.4掃描電鏡觀察采用參考文獻(xiàn)的方法制備得到聚酰胺6納米纖維。采用掃描電鏡進(jìn)行觀察,結(jié)果如圖2所示。纖維表面光滑,纖維直徑為200～300nm,當(dāng)電紡時(shí)間為2～6h時(shí),其膜厚度為70～200μm。2.5模擬血漿樣品的制備取兔血于肝素化的離心試管中,以3000r/min離心20min,取上清液得空白血漿,置于-20ue84aSymbolpB@C冰箱冷藏,測定前在37ue84aSymbolpB@C水浴融解。在10mL離心管中加入50μL不同濃度的酮康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液,準(zhǔn)確吸取200μL兔血漿,混勻,得到不同濃度的模擬血漿樣品。模擬血漿樣品中加入750μL乙腈,渦旋2min,以4000r/min離心10min。取上清液加水稀釋至一定體積,調(diào)節(jié)溶液pH值,并加入適量NaCl,即為待處理樣品溶液。取聚酰胺6納米纖維膜,將其裁剪成直徑約為1.8cm的圓形膜,緊密固定于過濾器中。過濾器兩端均為螺口,上方接樣品管,下方接收集器,接口均螺旋密封,制成樣品處理器,置于真空固相萃取裝置中。打開真空泵,樣品管加入的樣品液即可以一定速度通過聚酰胺6納米纖維膜。該裝置每次可同時(shí)處理8個(gè)樣品。其裝置如圖3所示。依次用200μL甲醇和200μL水清洗并活化聚酰胺6納米纖維膜。取待處理樣品溶液,以適當(dāng)流速通過納米纖維膜,吸附在膜上的目標(biāo)物以洗脫溶劑洗脫,取20μL洗脫液進(jìn)行HPLC分析。3結(jié)果與討論3.1樣品預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化選擇3.1.1聚酰胺6納米纖維膜酮康唑富集效率的測定結(jié)果溶液ph的確定在樣品溶液pH≤3時(shí),聚酰胺6納米纖維膜的結(jié)構(gòu)和形貌會(huì)發(fā)生變化,影響其使用壽命和富集效率。實(shí)驗(yàn)考察了樣品溶液為pH3～12時(shí)聚酰胺6納米纖維膜酮康唑的富集效率。結(jié)果表明,當(dāng)pH=10時(shí),富集效率最大。因此應(yīng)將待測樣品溶液的pH值調(diào)節(jié)為10。3.1.2金屬離子檢測無機(jī)鹽離子濃度提高時(shí),鹽析效應(yīng)可降低待測物在水中的溶解度,有利于增加其在納米纖維固相膜中的分配,從而提高萃取效率;另一方面,無機(jī)鹽離子濃度提高會(huì)導(dǎo)致水樣的粘度增大,從而阻礙溶質(zhì)分子的擴(kuò)散速度,不利于萃取。本研究考察了NaCl濃度為0～5%(w/V)時(shí),樣品溶液的離子強(qiáng)度對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)NaCl的加入量為2%時(shí),富集效率最大。3.1.3納米纖維膜對(duì)酮康唑的富集足量的納米纖維膜才能為目標(biāo)物質(zhì)提供充分的吸附位點(diǎn),以保證富集效率。本研究考察了0.5～3.0mg納米纖維膜對(duì)酮康唑的富集效果。當(dāng)納米纖維膜質(zhì)量從0.5mg增加至1.5mg時(shí),萃取效率明顯增加;但繼續(xù)增加纖維質(zhì)量,回收率不再增加。故聚酰胺6納米纖維膜的用量為1.5mg。每片膜至少可重復(fù)使用6次而回收率基本保持一致(RSD=3.2%)。3.1.4洗脫溶劑用量的篩選選擇相同體積的甲醇和乙腈作為洗脫溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,其洗脫效果相近。本研究選擇廉價(jià)低毒的甲醇作為洗脫劑,并以50～400μg/L線性范圍內(nèi)酮康唑單一對(duì)映體最高濃度(400μg/L)所需的洗脫劑體積,對(duì)其用量進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,100μL甲醇足以洗脫目標(biāo)物質(zhì)。3.1.5不利于提高工作效率樣品上樣速度過快,則目標(biāo)物與納米纖維接觸時(shí)間短,結(jié)合弱,富集效率低;速度慢則預(yù)處理時(shí)間延長,不利于提高工作效率。本研究對(duì)1～5mL/min不同上樣速度對(duì)絕對(duì)回收率的影響進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,上樣速度由1mL/min逐漸增加到3mL/min時(shí),富集效率略有下降,但仍能獲得滿意的回收率;隨速度繼續(xù)增大,回收率明顯下降。綜合考慮,上樣速度選擇3mL/min。3.1.6不同稀釋個(gè)數(shù)的聚酰胺納米纖維膜的絕對(duì)回收率血漿樣品經(jīng)過乙腈沉淀蛋白后,上清液需加水稀釋以降低樣液的溶劑強(qiáng)度,以保證固相萃取效率。稀釋倍數(shù)小,則樣品中乙腈含量高,樣液的溶劑強(qiáng)度大,目標(biāo)物與聚酰胺納米纖維膜作用力弱,酮康唑?qū)τ丑w的絕對(duì)回收率低;稀釋倍數(shù)大,樣品體積大,則可能大于樣品突破體積,使回收率下降,且前處理費(fèi)時(shí)。結(jié)果表明,適當(dāng)稀釋樣品,使其體積為25mL時(shí),回收率最高,所以選擇樣品體積為25mL。3.2方法學(xué)的檢驗(yàn)3.2.1加標(biāo)血樣的制備準(zhǔn)確量取血漿200μL,按2.5節(jié)兔血清樣品前處理方法,自“加入750μL乙腈”起進(jìn)行實(shí)驗(yàn),進(jìn)樣20μL,得空白血漿色譜圖(圖4A);準(zhǔn)確量取血漿200μL,加入相應(yīng)濃度的酮康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL,旋渦混合10min,配制成酮康唑外消旋體的加標(biāo)血樣,按2.5節(jié)兔血清樣品前處理方法,自“加入750μL乙腈”開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn),進(jìn)樣20μL,得加標(biāo)血樣色譜圖(圖4B)。結(jié)果表明,酮康唑?qū)τ丑w的保留時(shí)間分別為7.3和8.7min,先出峰的組分為(-)-KTZ,后出峰的組分為(+)-KTZ;空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)酮康唑?qū)τ丑w定量測定無干擾,在此條件下所得的測定結(jié)果能準(zhǔn)確表達(dá)酮康唑?qū)τ丑w濃度。3.2.2線性回歸實(shí)驗(yàn)精密準(zhǔn)確量取空白血漿200μL,加入濃度為0.50,1.00,2.00,2.50,3.00和4.00mg/L的酮康唑標(biāo)液各50μL,旋渦混勻,按2.5節(jié)兔血清樣品前處理方法,自“加入750μL乙腈”開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以酮康唑?qū)τ丑w的峰面積Y對(duì)其相應(yīng)的濃度X(μg/L)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明,酮康唑的兩個(gè)對(duì)映體(-)-KTZ和(+)-KTZ在50～400μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性(r>0.9990),定量限均為40.0μg/L(以S/N=10計(jì))。3.2.3回收率和精密度精密量取血漿200μL,加入相應(yīng)濃度的酮康唑標(biāo)液50μL,旋渦混勻,配制成酮康唑單一對(duì)映體濃度為50,200和400μg/L的模擬血漿樣品,每一濃度平行制作5份,連續(xù)5d,按2.5節(jié)兔血清樣品前處理方法,自“加入750μL乙腈”起進(jìn)行實(shí)驗(yàn),記錄酮康唑單一對(duì)映體的峰面積值,代入當(dāng)日的工作曲線計(jì)算測得濃度,考察方法的日內(nèi)和日間精密度。模擬血漿樣品經(jīng)上述前處理后,測得的各酮康唑單一對(duì)映體色譜峰面積與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣測得的色譜峰面積相比,得絕對(duì)回收率;測得的各酮康唑單一對(duì)映體色譜峰面積代入相應(yīng)工作曲線計(jì)算測得濃度,與酮康唑各單一對(duì)映體的配制濃度相比,得相對(duì)回收率。結(jié)果見表1。3.2.4不同濃度兔血漿前處理準(zhǔn)確量取血漿200μL,加入酮康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL,旋渦混勻,制成酮康唑單一對(duì)映體濃度分別為200.0μg/L的模擬血漿樣品,每種濃度平行制作5份,置于-20ue84aSymbolpB@C冰箱儲(chǔ)藏。分別于0,1,3,5和7d時(shí)置于37ue84aSymbolpB@C水浴融解,按2.5節(jié)兔血漿樣品前處理方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測定血漿中藥物濃度。(-)-KTZ和(+)-KTZ的測定均值分別為194.0μg/L(RSD=7.9%)和195.0μg/L(RSD=7.7%),表明血漿樣品在-20℃冰凍保存,7