肉類艾美耳球蟲生物學(xué)和免疫生物學(xué)研究進展

肉類艾美耳球蟲生物學(xué)和免疫生物學(xué)研究進展

球蟲病是以腸病為特征的原生動物，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)造成約80億歐元的損失。如果藥物的預(yù)防失敗，死亡率和發(fā)病率就會增加，損失將更加大。1艾美耳球蟲的發(fā)育禽類的艾美耳球蟲的生活史包括有性生殖階段和無性生殖階段,球蟲的生物學(xué)發(fā)育也比較清楚。通常,卵囊隨糞便排出,在外界環(huán)境中進行孢子生殖,有氧氣的環(huán)境下經(jīng)過大約24h孢子化。孢子化卵囊包含4個孢子囊,每個孢子囊含有2個子孢子。通過合適的途徑感染宿主,卵囊在腸腔內(nèi),在胰酶、膽汁和CO2的作用下脫囊,子孢子逸出并鉆入絨毛上皮細胞。有些種的子孢子如布氏艾美耳球蟲和早熟艾美耳球蟲,在鉆入位點的細胞內(nèi)發(fā)育。其他種的子孢子如堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲,被轉(zhuǎn)運到其他地方如上皮細胞下層發(fā)育。在宿主細胞內(nèi),子孢子進行無性生殖(或裂殖生殖),產(chǎn)生的裂殖子一部分進行下一代的發(fā)育,一部分出現(xiàn)性的分化,產(chǎn)生大配子體和小配子體,分別形成大配子和小配子,大小配子結(jié)合形成合子最后發(fā)育成卵囊隨糞便排出體外。整個發(fā)育階段為4~5d。最大卵囊產(chǎn)量于感染后6~9d不等。控制艾美耳球蟲在宿主細胞內(nèi)發(fā)育的生化和遺傳學(xué)機制目前尚不明了。但是,通過對柔嫩艾美耳球蟲的早熟株和耐藥株的研究,確定了與早熟和耐藥特性相關(guān)的連鎖群,定位在球蟲的1和2號染色體上。這些信息有助于確定控制柔嫩艾美耳球蟲生活史的遺傳座。從這個研究中可得到其遺傳分離數(shù)據(jù)。近年來其他的研究也確定了一些基因如ETS3a基因,也許在控制柔嫩艾美耳球蟲生活史中起重要作用,它的表達受到發(fā)育階段的調(diào)控。艾美耳球蟲代謝機制的研究也有了進展,如一些保護性抗原在免疫中的應(yīng)用和化學(xué)藥物的代謝途徑的研究。譬如,甘露醇循環(huán)在柔嫩艾美耳球蟲的孢子化過程中提供能量來源。這個途徑也許廣泛存在于其他的艾美耳球蟲種中。最近報道了柔嫩艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲的一些特征性的酶類,在禽類其他艾美耳球蟲中也表現(xiàn)一系列活性。2艾美耳球蟲致病性鑒定禽類的艾美耳球蟲,公認的有7種,分別是堆型艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲,每種都有特異的寄生部位。在6周齡以內(nèi)的雞群中常見的有6種,即堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲和早熟艾美耳球蟲,其中有5種致病性由中等到最強,具有特征性的病變。另一方面,和緩艾美耳球蟲和早熟艾美耳球蟲在自然條件下不會產(chǎn)生明顯的病變,雞群一般也不會出現(xiàn)死亡,被認為是無致病性的蟲種。但是,試驗感染也會導(dǎo)致腸炎、腹瀉,降低飼料轉(zhuǎn)化率,說明這2種也能引起經(jīng)濟損失,也需要預(yù)防和控制。Shirley第1個使用分子生物學(xué)方法如卵囊的同工酶譜來鑒別球蟲種。Ellis和Bumstead第1個通過特征性限制片段圖譜證實了用rRNA和rDNA探針能鑒別個體種。Procunier等用隨機引物DNA多態(tài)性方法鑒別了堆型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲并檢測出了種間差異。重組DNA技術(shù)被應(yīng)用于區(qū)別柔嫩艾美耳球蟲不同的株,并建立了早熟和耐藥株的標準,用PCR方法從基因組DNA擴增出了內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1,用于檢測和鑒別6個艾美耳球蟲種。用PCR二步法程序可以區(qū)分包括哈氏艾美耳球蟲在內(nèi)的8個種。用限制性片段長度多態(tài)性方法鑒定了6個澳大利亞球蟲種。這些PCR相關(guān)技術(shù)對于研究禽類球蟲病的流行病學(xué)調(diào)查是很有用的。3cd4+t細胞在抗感染免疫中的作用該領(lǐng)域進展較大的主要是E.vermiformis進行的遺傳改變小鼠感染模式的研究。TCRγδ+CD4+的主要組織相容性復(fù)合物II(MHC#II)限制性T細胞可以產(chǎn)生IFN#γ,對初次和再次感染產(chǎn)生抗原特異性反應(yīng)。此外,B細胞和IL#6也在初次感染中發(fā)揮作用,但不是必要的組分。其他的非MHC#II限制性細胞也參與再次感染的免疫記憶作用。由于缺乏遺傳改良的雞即敲除其免疫效應(yīng)因子基因的雞,和單克隆抗體制劑的缺乏,使得對禽類球蟲病引起的免疫反應(yīng)的細致研究變得更加困難。然而,有一些事實比較清楚,如初次感染會產(chǎn)生一些遺傳的抗性成分。機體對同種物質(zhì)的再次感染形成穩(wěn)定的免疫性。雖然產(chǎn)生的免疫性不會阻止子孢子對細胞的侵入,但是會抑制子孢子的進一步發(fā)育。初次感染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)效應(yīng)器及抵抗球蟲感染的效應(yīng)物質(zhì)主要是位于腸相關(guān)淋巴組織的T細胞。此時體液免疫反應(yīng)也會參與,但是抗體在該過程中只起到次要作用。用單克隆抗體對雞的腸道淋巴細胞的表面標志進行檢測,發(fā)現(xiàn)它與鼠和人的CD3、CD4和CD8T細胞具有相同的表面標志。發(fā)現(xiàn)CD3多肽復(fù)合物與抗原特異性的T細胞受體αβ或γδ異二聚體具有相關(guān)性,CD4+T細胞識別MHC#II抗原,CD8+T細胞識別MHC#I抗原。對雞來說,TCRγδ+T細胞或者是CD4+T細胞,或者是CD8+T細胞。這些T細胞在抗禽艾美耳球蟲感染中的作用與艾美耳球蟲在鼠體內(nèi)感染相比有所不同。研究表明,雞感染堆型艾美耳球蟲或柔嫩艾美耳球蟲激活的T細胞的某些種類可被單克隆抗體選擇性的抑制而衰竭,這也說明CD4+T細胞和CD8+T細胞在抗感染免疫中有不同的作用,這就使得感染不同的球蟲種,卵囊的產(chǎn)量也不同。雞感染堆型艾美耳球蟲,CD4+T細胞的衰竭在初次感染或人工感染中不會明顯增加卵囊產(chǎn)量。此外,攻毒感染比初次感染要產(chǎn)生較少的卵囊。這些研究結(jié)果表明,CD4+T細胞不是抗堆型艾美耳球蟲感染中的重要的免疫效應(yīng)器。另一方面,在柔嫩艾美耳球蟲初次感染中,CD4+T細胞的衰竭會導(dǎo)致卵囊產(chǎn)量的明顯增加,而攻毒感染不會增加,表明CD4+T細胞在抗柔嫩艾美耳球蟲初次感染中發(fā)揮重要作用。不論是柔嫩艾美耳球蟲初次感染,還是堆型艾美耳球蟲初次感染,CD8+T細胞的衰竭會明顯減少卵囊產(chǎn)量。理論上講,這種效應(yīng)是由于子孢子運輸載體———CD8+T細胞數(shù)量的減少引起的。但是,攻毒感染后,CD8+T細胞的衰竭會明顯增加卵囊產(chǎn)量。這些結(jié)果表明CD8+T細胞也許不是抗初次感染的效應(yīng)器,而在再次感染免疫中是必要的效應(yīng)器。CD8+T細胞在柔嫩艾美耳球蟲感染的保護性免疫中的重要性,可以通過初次感染期間它在外周血中數(shù)量上短暫的急劇增加的現(xiàn)象來解釋。實際上,雞體內(nèi)的CD8+T細胞似乎在抗球蟲感染的免疫中發(fā)揮雙重作用,這是由于對雙色免疫熒光染色感染的腸道取自遺傳背景不同的對球蟲敏感的雞。初次感染堆型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲期間,共表達的TCRγδ和CD8+的T細胞數(shù)量在上皮內(nèi)明顯增加,這個地方就是子孢子侵入的部位,因此認為這些細胞是將子孢子從黏膜固有層轉(zhuǎn)運到黏膜下層的載體,黏膜的CD8+T細胞在攻毒感染后,數(shù)量也會增加,這些細胞也經(jīng)常與被感染細胞緊密相鄰。理論上講,這些CD8+T細胞是作為毒性細胞發(fā)揮作用的,通過幫助殺死被感染細胞的方式來清除寄生性蟲體。球蟲也可以侵入腸黏膜內(nèi)的其他類型的白細胞。譬如,在嗜異性粒細胞內(nèi)柔嫩艾美耳球蟲的子孢子,在杯狀細胞和肥大細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲的裂殖子。這些結(jié)果與禽類球蟲病的免疫控制有無關(guān)聯(lián)性尚不清楚。類似于NK細胞(細胞表面表達低水平的CD8+和四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂)在初次感染的早期數(shù)量有所增加。這些細胞在體外表現(xiàn)NK細胞的活性,也許參與免疫監(jiān)督。初次和再次感染中,黏膜巨噬細胞可以吞噬子孢子,但是這種活性似乎在免疫雞群中也不會增強。巨噬細胞也許參與子孢子的轉(zhuǎn)運。活化的巨噬細胞可產(chǎn)生很多不同的炎癥細胞因子,這些因子可以調(diào)控細胞免疫反應(yīng)。黏膜肥大細胞數(shù)量在感染堆型艾美耳球蟲的早期和晚期增加,但是這些細胞對產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)和抗病性的作用尚不清楚。白細胞合成和分泌的細胞因子在抗感染的免疫反應(yīng)期間起著重要的調(diào)控作用。在禽類的球蟲病中,感染部位的宿主細胞可以產(chǎn)生IFN#γ,IFN#γ的釋放可以引起對球蟲抗原的T細胞反應(yīng)。用重組雞的IFN#γ治療球蟲感染雞群可以改善體增重。腫瘤壞死因子(TNF)是一種炎癥因子,由激活的巨噬細胞分泌。從感染雞群的受刺激巨噬細胞和血清中可以檢測到TNF#α樣活性。用TNF#α治療感染雞群會加重體增重的抑制作用,而用TNF#α的多克隆抗體治療會部分改善體增重。這些結(jié)果表明TNF#α在禽類感染球蟲病的病理生理學(xué)方面發(fā)揮重要作用。自由基包括活性氧族和NO+,都是活化的巨噬細胞和其他吞噬細胞的分泌產(chǎn)物,對細菌和一些寄生蟲有毒性作用。因此,這些因素在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。NADPH氧化酶在黏膜中的活性很強,可以產(chǎn)生超氧化物(如O2+)和一定水平的NO2-+NO3-。NO+穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物,在巨型艾美耳球蟲感染的雞群,不同的時間段產(chǎn)量不同,如感染后的1、3和6d,NADPH氧化酶達到最大量;NO2-+NO3-于感染后6d達到最大量。這些參數(shù)時間上的差異表明不同的細胞類型參與了這一過程。血漿中NO2-+NO3-的水平在初次感染堆型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲后大約第6d明顯升高,但是再次感染就不會出現(xiàn)這一現(xiàn)象。這一結(jié)果表明,NO+的產(chǎn)量與先天抗性的關(guān)系,與獲得性抗球蟲免疫反應(yīng)相比更加相關(guān)。初次感染柔嫩艾美耳球蟲期間,NO+的產(chǎn)量與抗性之間存在著一種遺傳關(guān)系。最近的體外研究表明,IFN#γ刺激的巨噬細胞可以產(chǎn)生NO,可以抑制柔嫩艾美耳球蟲在這些細胞內(nèi)增殖。4球蟲病的控制4.1嚴格控制豬、雞的毒種和消毒液禽舍的環(huán)境中,這樣就有大量繁殖的可能,很難使雞群不受感染,尤其是在密集型飼養(yǎng)的雞群中。卵囊很容易在禽舍的廢物中孢子化。但是,它們也很容易被細菌、其他微生物和消毒液如氨水等殺死,一般3周以后它們的生存能力開始減弱或喪失。很多美國養(yǎng)殖場的管理者基本上都會清除禽舍內(nèi)大的廢物,讓舍內(nèi)通風(fēng)2~3周,然后換上新的墊料,再引進雛雞。此外,歐洲的一些國家和加拿大通常在2批雞期間進行禽舍的徹底消毒清洗。還有一些措施如要求飼養(yǎng)員進出禽舍換衣服以減小感染性卵囊的傳播,這樣做可以有效地降低球蟲病發(fā)生的危險性。嚴格的生物安全制度在肉雞養(yǎng)殖中也是至關(guān)重要的。4.2抗菌類藥物添加劑的有效應(yīng)用對于保證養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展起著重要的作用。這些抗球蟲制劑可分為以下幾類:(1)化學(xué)藥物。具有特異性作用于蟲體的某一代謝途徑而發(fā)揮抑制或殺滅作用,如安普羅銨、氯吡多、癸氧喹酯、溴氯哌喹酮等。(2)離子載體類多聚物。如莫能菌素、拉沙里菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素、馬杜拉霉素,這些藥物可通過改變離子運輸方式和破壞滲透平衡來抑制蟲體的代謝途徑。離子載體類多聚物是現(xiàn)在抗球蟲藥的主流。但是,抗球蟲藥的耐藥性問題包括離子載體類藥物已經(jīng)成為當前最困難的問題。為了盡可能減小抗藥性的影響,一些養(yǎng)殖者采取輪換用藥策略和聯(lián)合用藥方案或者穿梭用藥。這些方案的使用要根據(jù)季節(jié)條件和不同球蟲的流行情況而定。4.3蟲病的測定因此,疫苗也就能夠代替藥物作為控制球蟲病的一種方法。在過去的幾十年中,一直在努力研制不同類型的疫苗,但是進展比較緩慢,對疫苗研究的熱點也在于此。4.3.1抗感染的基因表達過去的10年間,很多研究都集中在重組疫苗的研制上,盡管到現(xiàn)在為止還沒有一個應(yīng)用于商業(yè),但這些研究結(jié)果已經(jīng)用于闡明宿主與球蟲之間相互作用的復(fù)雜的本質(zhì)。重組疫苗研制的主要障礙是缺乏蟲種的交叉免疫保護。當然還有一些其他的因素,其中最重要的是保護性抗原的鑒定。比如從很多不同種和不同發(fā)育階段鑒定了29個編碼產(chǎn)免疫的DNA序列。這些抗原中的多數(shù)是與表面蛋白或與細胞器如微線體、棒狀體和折光體有關(guān)的內(nèi)部抗原,如最近報道的存在于柔嫩艾美耳球蟲的內(nèi)源性發(fā)育階段的一個識別單個抗原表位的低分子量抗原。一些代謝抗原,如發(fā)育階段子孢子抗原、裂殖子抗原和配子體抗原,都可引發(fā)不同程度的保護性免疫反應(yīng)。球蟲疫苗產(chǎn)生抗感染的運輸機制仍有待確定。艾美耳球蟲的免疫原性的抗原可被制成乳化的分離蛋白口服,重組抗原借助活載體如非致病性的大腸桿菌、鼠傷寒血清型沙門氏菌、痘病毒、雞痘病毒和火雞皰疹病毒口服,或者用質(zhì)粒DNA直接注射,都取得了不同程度的成功。需要進一步研究來確定疫苗是如何作用于細胞免疫效應(yīng)系統(tǒng),來確定宿主針對每一種寄生蟲產(chǎn)生的獨特的免疫反應(yīng)。因為T細胞激活抗原是與產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)最相關(guān)的,T細胞增殖試驗和INF#γ的產(chǎn)生被用于篩選抗柔嫩艾美耳球蟲感染的保護性抗原。引起T細胞高度增殖和巨噬細胞高度活化的抗原作為疫苗免疫雞群,攻毒后可以產(chǎn)生很低的病變記分。4.3.2以免疫后攻毒、以抗球蟲為主的多價免疫疫苗在過去的50年間,活疫苗也在一定程度上應(yīng)用于控制球蟲病。這些活蟲苗在體內(nèi)產(chǎn)生少量的卵囊并逐漸加強宿主的免疫性。主要用于保護種雞和產(chǎn)蛋雞。近年在肉雞上的應(yīng)用呈上升的趨勢。活疫苗包括弱毒苗和強毒苗。Paracox和Livacox都是弱毒苗,所有的球蟲疫苗都對藥物敏感。Coccivac和Immucox每一種都是由7個球蟲毒株構(gòu)成。這4種疫苗已在國內(nèi)外商業(yè)雞場廣泛應(yīng)用。Bedrnik對這4種疫苗進行了比較。這些疫苗于孵出后第1周內(nèi)口服接種,在較好的飼養(yǎng)條件下可產(chǎn)生穩(wěn)固的免疫力。因為活疫苗都是多價苗,對其效果的好壞需要不同的抗球蟲試驗來驗證。標準方法是以免疫后攻毒試驗雞的體增重率為基礎(chǔ),進而考查病變積分的減少和卵囊產(chǎn)量的降低。弱毒疫苗的優(yōu)點是蟲種本身具有很低的繁殖潛能,這樣可以避免感染的特異腸道黏膜部位因繁殖數(shù)量多而出現(xiàn)擁擠的現(xiàn)象,從而以最小的組織損傷來引起最佳免疫性的建立。藥物敏感株和野生田間株在體內(nèi)雜交,可以降低田間株的毒力和對藥物的抗性。這樣,通過活疫苗的輪換應(yīng)用可以延長抗球蟲藥的使用期限。Coccivac和Immucox2種疫苗也可用于肉雞,尤其在美國和加拿大應(yīng)用廣泛。此外,應(yīng)用活疫苗也有一定的風(fēng)險,如散播到環(huán)境中將污染環(huán)境。盡管如此,研究試驗表明這種類型的疫苗如Immucox與用化學(xué)藥物治療相比,能夠產(chǎn)生同樣或較好的效果,原因可能是這種方法確保了雞群體內(nèi)總是帶有少量的卵囊以持續(xù)刺激機體的免疫系統(tǒng)。球蟲的抗原性隨著地域的不同而不同。因此,在將疫苗大規(guī)模應(yīng)用于雞群前,篩選出抗地域性蟲種的弱毒疫苗尤為重要。分離具有免疫差異的蟲株可作為地域特異性活疫苗的候選疫苗?；钜呙缫部梢酝ㄟ^與抗藥蟲株雜交而得到改良。在平養(yǎng)試驗中,用耐藥蟲株免疫1日齡的肉仔雞,可以完全抵抗同種球蟲的感染。當大規(guī)模免疫雞群時,獲得免疫的雞與對照組相比仍然表現(xiàn)出很低的飼料轉(zhuǎn)化率和幾乎可以忽略的體增重。因此,這種類型的疫苗具有延長抗球蟲時間的潛力,在耐藥蟲株存在的地域和球蟲病沒有很好控制的地域使用仍然是一個問題。4.3.3堆型艾美耳球蟲和評論員的免疫作用細胞因子是抗感染免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,因此細胞因子是幫助疫苗提高免疫刺激的自然免疫佐劑的來源。IFN#γ作為抗球蟲疫苗可能的佐劑已引起廣大學(xué)者的關(guān)注。雞的IFN#γ基因已經(jīng)被克隆。重組的IFN#γ已經(jīng)表現(xiàn)出在感染堆型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲期間體增重下降減緩,堆型艾美耳球蟲卵囊產(chǎn)量減少。細胞因子體內(nèi)使用的一個問題是,它們很快被降解和清除。以DNA形式或細菌、病毒載體形式可以克服這一問題,并可以大規(guī)模使用。例如,堆型艾美耳球蟲裂殖子的重組蛋白3#1E,同時存