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不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控劑對(duì)嚴(yán)重?zé)齻∈笃⒘馨图?xì)胞分泌il-2、il-10功能的影響
感染是燒傷患者死亡的主要原因之一。機(jī)體免疫功能受損,仍然是燒傷后引起感染的重要內(nèi)在因素。此時(shí),機(jī)體獲得性免疫和天然免疫應(yīng)答的多種免疫細(xì)胞和免疫分子均可發(fā)生不同程度的改變,主要表現(xiàn)為特異性細(xì)胞免疫功能受抑和非特異性炎性反應(yīng)亢進(jìn),而細(xì)胞免疫受抑又以T淋巴細(xì)胞功能受抑尤為突出。因此細(xì)胞免疫功能受損是嚴(yán)重?zé)齻蟛l(fā)感染及其他并發(fā)癥的重要原因之一。筆者通過觀察不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控劑對(duì)嚴(yán)重燙傷小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素(IL)2、IL-10功能的影響,以探討通過調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶分子活性糾正嚴(yán)重?zé)齻笫軗pT淋巴細(xì)胞分泌功能的可行性。t細(xì)胞分離純化1.主要試劑:伴刀豆球蛋白A(ConA)及5種調(diào)控劑——膜蛋白激酶(PKC)抑制劑H-7、PKC的激活劑佛波酯(TPA)、絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)抑制劑PD098059、非受體型蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制劑Herbimycin、Ca2+導(dǎo)入劑A23187為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒為深圳晶美生物工程有限公司產(chǎn)品;酸性α-2醋酸萘酯酶(ANAE)染色試劑、錐蟲藍(lán)為重慶化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。2.動(dòng)物分組及細(xì)胞培養(yǎng):昆明種小鼠60只,購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,雌雄各半,體重為23~26g。取20只小鼠不燙傷,分為正常對(duì)照組(10只)、調(diào)控劑組(10只)。另取40只小鼠,將其背部剪毛,清醒狀態(tài)下高壓熱水蒸氣造成18%TBSAⅢ度燙傷(經(jīng)病理切片證實(shí)),傷后腹腔注射等滲鹽水3ml。將其分為燙傷12h組、燙傷12h+調(diào)控劑組、燙傷96h組、燙傷96h+調(diào)控劑組,每組10只。各組小鼠于相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)由腋動(dòng)脈放血處死,取脾臟無菌條件下制備脾細(xì)胞懸液,分離純化T淋巴細(xì)胞。(1)正常對(duì)照組:取分離純化的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞1ml,濃度為5×106個(gè)/ml,置體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)48h,離心收集上清液待測(cè)。(2)調(diào)控劑組:取10只小鼠分離純化的T淋巴細(xì)胞各5ml,濃度同前。將其各自分成5份,每份1ml。分別加入50μmol/LH-71ml;30μmol/LTPA1ml;10μmol/LHerbimycin1ml;25μg/mlPD0980591ml,均作用15min;加入100nmol/LA231871ml,作用30min(稱為H-7、TPA、Herbimycin、PD098059、A23187組),置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱培養(yǎng)30min,無菌條件下離心去上清液,加入10mg/LConA0.5ml和RPMI16400.5ml,置上述環(huán)境中培養(yǎng)48h,離心收集上清液,-20℃保存待測(cè)。(3)燙傷12h組:傷后12h取T淋巴細(xì)胞,同樣方法培養(yǎng)48h,離心收集上清液待測(cè)。(4)燙傷12h+調(diào)控劑組:傷后12h取材,處理同調(diào)控劑組。(5)燙傷96h組:傷后96h取材,處理同燙傷12h組。(6)燙傷96h+調(diào)控劑組:除傷后96h取材外,其余處理調(diào)控劑組。3.T淋巴細(xì)胞分離純化:參照文獻(xiàn)方法,以尼龍毛纖維分離細(xì)胞懸液中的T淋巴細(xì)胞,ANAE染色證明96%以上為T淋巴細(xì)胞,錐蟲藍(lán)染色證明T淋巴細(xì)胞存活率>95%,可用于下述實(shí)驗(yàn)。4.T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-10含量檢測(cè):收集各組培養(yǎng)細(xì)胞的上清液,采用ELISA法檢測(cè)IL-2、IL-10水平,操作按試劑盒說明書進(jìn)行。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)均以表示,采用STAT510統(tǒng)計(jì)軟件行方差分析、方差齊性檢驗(yàn)等。il-2及il-10水平1.加入H-7能使H-7組、燙傷12h+H-7組及燙傷96h+H-7組的IL-2、IL-10分泌降低(P<0.01)。同時(shí),燙傷12h+H-7組IL-2/IL-10比值明顯低于正常對(duì)照組及燙傷12h組(P<0.01)。見表1。2.與燙傷12、96h組比較,燙傷12h+TPA組IL-2、IL-10水平明顯升高(P<0.05或0.01),燙傷96h+TPA組無明顯變化。燙傷12h+TPA組的IL-2/IL-10比值恢復(fù)較明顯(P<0.05)。見表2。3.與正常對(duì)照組比較,PD098059組IL-2、IL-10分泌明顯降低(P<0.05或0.01);與燙傷12h組比較,燙傷12h+PD098059組IL-2分泌降低(P<0.05)。IL-10在12h+PD098059組和燙傷96h+PD098059組均顯著降低(P<0.01)。見表3。4.Herbimycin能顯著降低Herbimycin組、燙傷12、96h+Herbimycin組IL-2分泌(P<0.01),對(duì)IL-10亦有明顯抑制(P<0.05或0.01),但不如IL-2作用顯著,見表4。5.燙傷12h+A23187組及燙傷96h+A23187組IL-2分泌水平分別較燙傷12、96h組升高(P<0.05或0.01),對(duì)IL-10的作用與IL-2相同。見表5。不同途徑中小企業(yè)t細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性嚴(yán)重?zé)齻蓪?dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂,即特異性細(xì)胞功能受抑和非特異性炎性反應(yīng)亢進(jìn)。其中特異性細(xì)胞免疫功能受抑以T淋巴細(xì)胞功能受抑為顯著,可表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞經(jīng)絲裂原活化后的增殖能力降低,IL-2生成減少。IL-10又稱細(xì)胞因子合成阻抑因子,它能阻止輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)l產(chǎn)生干擾素γ、IL-2等細(xì)胞因子,能通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)單核細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類分子表達(dá),抑制單核細(xì)胞的抗原呈遞能力,從而阻止抗原特異性T淋巴細(xì)胞的增殖。T淋巴細(xì)胞經(jīng)T淋巴細(xì)胞抗原識(shí)別受體(TCR)和CD28接受抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激后,經(jīng)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),在胞內(nèi)通過第二信使或(和)多種信號(hào)途徑將信號(hào)傳入核內(nèi),開放或關(guān)閉、增強(qiáng)或減弱基因表達(dá),從而影響細(xì)胞功能活性。因此,T淋巴細(xì)胞跨膜和胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是T淋巴細(xì)胞活化和執(zhí)行功能所需的必經(jīng)信號(hào)通路,轉(zhuǎn)膜PKC和胞質(zhì)PKC是T淋巴細(xì)胞活化不可替代的必經(jīng)信號(hào)通路。筆者以往的研究證明,燒傷后T淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受抑是T淋巴細(xì)胞功能受抑和IL-2分泌水平降低的重要分子機(jī)制。筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用部分調(diào)控劑,通過阻斷某信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(或途徑)證明其在IL-2、IL-10分泌中的作用,通過活化某信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,觀察其對(duì)T淋巴細(xì)胞功能受抑的調(diào)控效應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)兩條通路存在于T淋巴細(xì)胞胞質(zhì),是受鳥苷三磷酸(GTP)和PTK作用的兩條并行通路。本實(shí)驗(yàn)通過阻斷某一通路后IL-2、IL-10分泌水平的改變,來確定其是否參與該因子分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和其參與的程度。將MAPKK抑制劑PD098059加入細(xì)胞中觀察IL-2、IL-10分泌情況,結(jié)果提示MAPK通路是正常和燒傷后T淋巴細(xì)胞活化并分泌IL-10的一條重要信號(hào)通路,而該通路對(duì)IL-2分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同樣必要,但其重要性次于肌醇磷脂途徑。PD098059雖然能夠升高燙傷12h+PD098059組的IL-2/IL-10比值,但該比值的恢復(fù)是在IL-2以及IL-10均降低情況下的一種平衡。H-7是異喹啉磺酰胺類化合物,為特異的PKC抑制劑。本實(shí)驗(yàn)觀察到,由PKC參與的PI-PLC途徑對(duì)IL-2分泌具有重要性,進(jìn)一步證明該途徑參與了正常和燒傷小鼠T淋巴細(xì)胞IL-10分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PKC激動(dòng)劑TPA具有穿膜刺激膜結(jié)合PKC的特性,它能使傷后12hT淋巴細(xì)胞IL-2、IL-10分泌增多;而對(duì)傷后96h的分泌無明顯影響。提示傷后96h前,PKC轉(zhuǎn)膜減少是導(dǎo)致IL-2、IL-10分泌量減少的重要原因之一。PTK是一個(gè)大家族,包括受體型、非受體型和胞質(zhì)型等,每一型中又有數(shù)量不等的亞型。PTK抑制劑Herbimycin用于T淋巴細(xì)胞后、IL-2、IL-10分泌量明顯降低,但I(xiàn)L-2更為顯著。從而間接證明對(duì)IL-10分泌的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),可能存在有PTK的并行途徑,如G蛋白等。細(xì)胞內(nèi)鈣缺乏或鈣超載皆可引起細(xì)胞功能異常和疾病的發(fā)生,目前所觀察到的胞內(nèi)鈣濃度異常只有少部分是由胞內(nèi)鈣缺乏所致,多數(shù)疾病由胞內(nèi)鈣超載所引起。燒傷后T淋巴細(xì)胞功能抑制,其發(fā)生機(jī)制屬于前者。A23187是一種離子載體,能協(xié)助肌漿網(wǎng)和部分胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)觀察到,A23187能明顯升高燙傷12h+A23187組及燙傷96h+A23187組IL-2、IL-10分泌量。說明傷后胞質(zhì)Ca2+濃度降低是T淋巴細(xì)胞功能受抑和IL-2分泌減少的重要原因。但有研究表明,傷后168hCa2+濃度仍顯著低于正常,而IL-10分泌量卻顯著升高,說明T淋巴細(xì)胞活化和分泌IL-10存在著并行于Ca2+的另一重要第二信使。筆者前期的研究及本實(shí)驗(yàn)觀察到,轉(zhuǎn)膜PKC傷后早期活性均降低,其變化趨勢(shì)與T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-10的活性改變呈正相關(guān)。PKC抑制劑H-7能加重傷后IL-2與IL-10的比例失調(diào)(從0.65降低至0.08),從而可以推斷嚴(yán)重?zé)齻骉淋巴細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)處于其活化信號(hào)的重要地位,即參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)膜PKC活性受抑,是制約燒傷后T淋巴細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素。PTK阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明
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