第六章 植物細胞制藥

第六章植物細胞工程制藥第一節(jié)概述人們利用植物作為藥物已有幾千年的歷史了，尤其是我國對中草藥的應用。高等植物的次生代謝產(chǎn)物豐富多樣，應用范圍廣。植物代謝產(chǎn)物多為混合物，其比例很關鍵。植物是活性化合物的最豐富的來源。通過植物細胞的大量培養(yǎng)可以解決植物生長周期長、代謝成分復雜等問題，以獲得大量活性物質(zhì)。植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)天然藥物并實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵是提高單位培養(yǎng)基中目的物質(zhì)的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，包括改進培養(yǎng)條件、篩選高產(chǎn)細胞株、研制適合于植物細胞大量培養(yǎng)的新型生物反應器。一、植物細胞工程技術(shù)及應用

植物細胞工程：是指以植物細胞為基本單位，應用細胞生物學、分子生物學等理論和技術(shù)，在離體條件下進行培養(yǎng)、增殖，使細胞的某些生物學特性按照人們的意愿發(fā)生改造，從而改良品種、制造新品種、加速繁育植物個體或獲得有用物質(zhì)的一門科學或技術(shù)。植物細胞工程主要由兩部分構(gòu)成：上游工程，包含細胞培養(yǎng)、細胞遺傳操作和細胞保藏三個步驟。下游工程，將已轉(zhuǎn)化的細胞應用到工業(yè)生產(chǎn)中，生產(chǎn)生物產(chǎn)品的過程。其中細胞培養(yǎng)是細胞工程的技術(shù)基礎。1、植物細胞工程技術(shù)（1）快速繁殖技術(shù)

通過植物體細胞胚胎再生成一完整植株。這種技術(shù)主要用于花卉、樹木、蔬菜、果樹、中草藥和農(nóng)作物的快速繁殖。（2）誘導增加或減少植物體內(nèi)染色體組數(shù)的技術(shù)

有些植株的染色體比正常細胞少一半（單倍體），而有些經(jīng)誘導后染色體加倍（多倍體）。單倍體有利于植物品種的改良；多倍體產(chǎn)量高，為不同倍性植物間的雜交提供了遺傳保證。（3）體細胞雜交技術(shù)

利用自然或人工方法使兩個或幾個不同細胞融合成一個細胞，形成體細胞雜種。（4）植物細胞生產(chǎn)應用技術(shù)

利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)，提供植物細胞最適宜的生活環(huán)境，進行無性繁殖，大量地培養(yǎng)成植株，解決天然資源的不足。2、植物細胞工程的應用（1）細胞育種誘導突變，篩選新品系、新品種。（2）次級代謝產(chǎn)物生成從培養(yǎng)的植物細胞中提取所需的代謝產(chǎn)物。優(yōu)點：比栽培原料作物更易控制最佳生產(chǎn)條件；培養(yǎng)物為無菌材料，能保證產(chǎn)品質(zhì)量；工藝操作較為簡單，可減少成本，提高生產(chǎn)率。3、植物細胞工程生產(chǎn)的藥物目前，已經(jīng)從400多種植物中分離出細胞，通過細胞培養(yǎng)，獲得600多種所需的化合物，其中有60多種在含量上超過或趨于原植物，包括色素、固醇、生物堿、維生素、激素、多糖、植物殺蟲劑及生長素等數(shù)十類。已有紫杉醇、紫草素、迷迭香酸和人參皂苷等產(chǎn)品進入工業(yè)化生產(chǎn)階段。二、植物細胞工程發(fā)展簡史

19世紀上半葉，提出了細胞學說。20世紀初葉，德國著名植物學家依據(jù)細胞理論，首次提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至單個細胞。20世紀20年代初至30年代，胚胎培養(yǎng)和器官培養(yǎng)取得了一些成果。

30年代末至40年代，研究工作主要集中在植物細胞器官與營養(yǎng)需求之間的關系。40年代末至50年代，植物組織培養(yǎng)取得新進展，確定了腺嘌呤和生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。

60年代初，分離出植物的原生質(zhì)體。

60至70年代中葉，主要工作是開發(fā)培養(yǎng)基和研究培養(yǎng)方法。

1975-1985年主要進行優(yōu)化細胞生長和次級代謝產(chǎn)物形成的研究。最近10年應用分子生物學，取得紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌新藥紫杉醇成果?，F(xiàn)在已經(jīng)具備在２萬升規(guī)模的生物反應器中培養(yǎng)煙草細胞的能力。日本的三井石化使用750L發(fā)酵罐通過培養(yǎng)植物細胞生產(chǎn)紫草寧，產(chǎn)量較高，可滿足全日本百分之四十以上的需要。三、相關概念1、植物組織培養(yǎng)在無菌條件下，對離體植物組織（器官或細胞）分離并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生長，甚至分化發(fā)育成一完整的植株的一門實驗技術(shù)。目前已發(fā)展出愈傷組織培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)等類型的植物組織培養(yǎng)。2、植物細胞的全能性即植物體的每個細胞攜帶著一套完整的基因組，故具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。

組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細胞的全能性。植物組織體內(nèi)原本已經(jīng)分化的細胞，一旦脫離原有的機體環(huán)境，成為離體狀態(tài)，在適宜的營養(yǎng)和外界條件下，就會表現(xiàn)出全能性，從已經(jīng)分化定型的細胞，脫分化，成為恢復分裂能力的細胞，并能重新生長發(fā)育成完整的植株。3、愈傷組織

愈傷組織是指一個離體的細胞、一塊組織或一個器官的細胞，通過脫分化不斷分裂、增生子細胞，這些細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明，逐漸形成無序結(jié)構(gòu)的一團細胞。4、懸浮培養(yǎng)在愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)基礎上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術(shù)。以能夠保持較好分散性的離體細胞或較小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。5、細胞培養(yǎng)

利用單個細胞進行液體或固體培養(yǎng)，誘導其增殖及分化。目的是為了得到單細胞無性繁殖系。6、分生組織培養(yǎng)

又稱生長錐培養(yǎng)，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細胞。

7、器官培養(yǎng)指植物根、莖尖、葉、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟小果實的無菌培養(yǎng)。8、胚胎培養(yǎng)對植物的胚(種胚)及胚器官(如子房,胚珠)進行人工離體無菌培養(yǎng)，使其發(fā)育成幼苗的技術(shù)。

9、外植體從植物體上分離下來的用于離體培養(yǎng)的材料（器官或組織）。植物的個部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進行組織培養(yǎng)。

10、器官形成一般指在組織培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)物中芽、根或花等器官的分化與形成。11、無性繁殖

又叫克隆，指使用母體培養(yǎng)物反復進行繼代培養(yǎng)時，通過同種外植體而獲得越來越多的無性繁殖后代。

12、突變體

細胞本身發(fā)生遺傳變異或應用誘變處理發(fā)生的遺傳變異所得的新細胞。

13、繼代培養(yǎng)

由最初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”，連續(xù)多代的培養(yǎng)就稱為繼代培養(yǎng)。14、次級代謝作用和次級代謝產(chǎn)物

除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白質(zhì)及糖類以外，具有如下特征的成分為次級代謝產(chǎn)物：有明顯的分類學區(qū)域界限；其合成需在一定的條件下才能發(fā)生；缺乏明確的生理功能；是生命的多余成分。

次級代謝作用是特殊蛋白質(zhì)內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合體現(xiàn)。生物堿、黃酮體、萜類、有機酸、木質(zhì)素等。第二節(jié)植物細胞的形態(tài)及生理特性一、植物細胞的形態(tài)單細胞植物，藻類；多細胞植物其細胞形態(tài)多種多樣，球形、類圓形、橢圓形、角形；具有支持作用的細胞的細胞壁常增厚，類圓形、紡錘形；具有輸導作用的細胞呈管形。

細胞大小不一，基本組織細胞體積較大，直徑在20-100微米之間；儲藏組織細胞的直徑可達1毫米；最長的細胞是無節(jié)乳管，長達數(shù)米至數(shù)十米。二、植物細胞的結(jié)構(gòu)特征高等植物為真核生物，在光學顯微鏡下，細胞壁、細胞核和液泡以及細胞內(nèi)一些較大的結(jié)構(gòu)容易辨認。植物細胞由細胞壁和原生質(zhì)體組成，原生質(zhì)體包括細胞質(zhì)、細胞核和液泡。與動物細胞相比植物細胞有三個特點，即具有細胞壁、液泡和質(zhì)體（葉綠體）。三、細胞后含物和生理活性物質(zhì)

細胞中除含有生命物質(zhì)原生質(zhì)體外，還有許多非生命物質(zhì)（亦稱后含物）。細胞的代謝產(chǎn)物，一類是后含物，是儲藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)，分布于液泡內(nèi)，如糖類、鹽類、生物堿、糖苷類、有機酸、揮發(fā)油等；另一類是生理活性物質(zhì)，對細胞內(nèi)生化代謝和生理活動起著調(diào)節(jié)作用，如酶、維生素、植物激素、植物殺菌素等。1、細胞后含物（1）生物堿：含氮有機化合物，中藥含有多種生物堿，如麻黃堿、咖啡因、阿托品、奎寧、黃連素等。（2）糖苷類：某些有機化合物和糖經(jīng)糖苷鍵結(jié)合而成，對疾病有很好的治療作用。（3）揮發(fā)油：具有芳香氣味，如薄荷油、丁香油和桉油等。（4）有機酸：糖類代謝的中間產(chǎn)物，如蘋果酸、檸檬酸、水楊酸、酒石酸等。2、生理活性物質(zhì)

對細胞內(nèi)生化反應和生理活動起調(diào)節(jié)作用。

（1）酶類：生物催化劑；

（2）維生素：參與酶的形成，對植物生長、呼吸、物質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用；

（3）植物激素：調(diào)節(jié)代謝；

（4）抗生素和植物殺菌素：殺死和抑制某些微生物生長的物質(zhì)。四、植物培養(yǎng)細胞的生理特性植物培養(yǎng)細胞不同生長階段的持續(xù)時間及特征（表）生長階段持續(xù)時間特征延遲期分裂的初始期取決于培養(yǎng)前的細胞數(shù)恒定，RNA含量高，和最大生長期條件、時間和培蛋白質(zhì)合成強，有絲分裂之間養(yǎng)基性質(zhì)加速，細胞的細胞質(zhì)部分增加。加速期細胞最大生長期3-4代細胞數(shù)、DNA、蛋白質(zhì)濃度和最大細胞濃度增加，有絲分裂活性、RNA最佳DNA和蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成能力降累積率。

低。對數(shù)期介于最大生長率蛋白質(zhì)合成能力完全減退和蛋白質(zhì)合成完多聚核糖體解離。全停止期之間

穩(wěn)定期細胞數(shù)穩(wěn)定細胞高液泡化、極度脆弱、有機化合物濃度高（1）植物細胞重量的增加主要在對數(shù)期，而次級代謝產(chǎn)物的累積主要在穩(wěn)定期。（2）植物細胞多以非均相集合體的細胞團形式存在，細胞團產(chǎn)生的原因有：①細胞分裂之后沒有進行細胞分離；②在間歇培養(yǎng)過程中，細胞處于對數(shù)生長后期時，開始分泌粘多糖和蛋白質(zhì)，或以其他方式形成粘性表面，從而形成細胞團。（3）細胞外骨架相當脆弱，表現(xiàn)為抗張力強度大，抗剪切力能力小，要采用合適的攪拌。（4）所有植物細胞都是好氣性的，培養(yǎng)需通氣，但不需要很高的氣液傳質(zhì)速率，而是要控制供氧量，以保持較低的溶氧水平。（5）泡沫性質(zhì)不同于微生物發(fā)酵，氣泡大，黏度也大，通常要采用化學或機械方法加以控制。（6）培養(yǎng)過程中可能會黏附于反應器壁、電極或擋板的表面上。第三節(jié)植物細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物的基本過程：材料準備（外植體的選擇、培養(yǎng)條件選擇）

誘導分化愈傷組織繼代培養(yǎng)（優(yōu)良細胞系篩選、建立）

規(guī)?；a(chǎn)培養(yǎng)

產(chǎn)品提取、分離純化一、材料的準備

1、外植體的選擇與高產(chǎn)細胞株的建立適宜于工業(yè)化生產(chǎn)的細胞株，應達到下列基本條件：分散性好，適于工業(yè)化生產(chǎn)；細胞形態(tài)均一性好，甚至在生理生化狀態(tài)上同步；生長迅速；細胞中次生產(chǎn)物含量高；細胞生長和次生產(chǎn)物合成能力穩(wěn)定。（1）外植體的選擇選擇次生代謝產(chǎn)物含量較高的原植物為外植體；天然產(chǎn)物一般為次級代謝產(chǎn)物，在起始細胞培養(yǎng)時，應盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織為外植體。同時，考慮同一植物不同部位外植體的分化能力、分化條件及分化類型。（2）高產(chǎn)細胞株的建立以愈傷組織作為規(guī)模細胞培養(yǎng)的細胞來源，在外植體選定后，首先要誘導愈傷組織，在外植體誘導出愈傷組織后，篩選生長快、次級代謝產(chǎn)物合成能力強的細胞系。篩選高產(chǎn)細胞系的方法：直接篩選法和誘變篩選法。高產(chǎn)細胞系建立的方法：①廣泛采集屬內(nèi)或科內(nèi)不同種、不同年齡、不同地區(qū)、不同器官的高含量親本株的外植體誘導新的愈傷組織，建立新的無性細胞系；②建立直板法及細胞團塊法從細胞系中快速分離篩選高產(chǎn)細胞株；③采用特定培養(yǎng)基進行定向富集篩選，獲得激素自養(yǎng)型及耐受高劑量細胞毒化劑的馴化系；④對細胞繼代穩(wěn)定性進行研究，建立有利于高產(chǎn)細胞株種質(zhì)穩(wěn)定的繼代培養(yǎng)方法。（3）外植體處理用于植物組織培養(yǎng)的外植體，必須無菌材料。外植體如果含有其他微生物，要進行嚴格的滅菌，以免在培養(yǎng)基中微生物大量迅速繁殖而影響植物組織的培養(yǎng)。常用表面滅菌試劑，其特點是滅菌后易于除去或容易分解。根據(jù)所處理材料對滅菌試劑的敏感性選擇適當?shù)奶幚頃r間。常用滅菌試劑有次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞。次氯酸鈣為工業(yè)漂白粉過濾后的飽和溶液，適用于草本植物和柔軟組織的滅菌處理，時間為5-30min。氯化汞滅菌效果好，但不易除去，時間不易過長，以免殺死植物細胞。其用于休眠種子的滅菌劑最為理想，適用濃度為0.1%，2-10min，種子皮較厚時可延長至20min以上。

2、培養(yǎng)基及其組成

培養(yǎng)基是植物離體器官、組織或細胞等的無菌土壤，營養(yǎng)成分可調(diào)控。

植物細胞或組織培養(yǎng)基常含有無機鹽、碳源、有機氮源、植物生長激素、維生素等成分。應用最廣泛的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的，無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的離子平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要。硝酸鹽(鉀、銨)的含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。B5培養(yǎng)基1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的。其主要特點是含有較低的銨，從實踐中得知，有些植物在B5培養(yǎng)基生長更適宜：如雙子葉植物特別是禾本植物。white培養(yǎng)基1934年white為培養(yǎng)番茄根尖而設計的，1963年又作了改良。本培養(yǎng)基的特點是無機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。KM-8P培養(yǎng)基1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設計的。其特點是有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素、呼吸代謝中的主要有機酸。廣泛應用于原生質(zhì)體和融合體的培養(yǎng)。LS培養(yǎng)基與MS基本成分較為接近，LS培養(yǎng)基去掉了甘氨酸、鹽酸吡哆醇和煙酸。

（1）無機鹽

基本培養(yǎng)基是由各種濃度的無機鹽溶液組成。無機鹽又分為大量元素和微量元素。大量元素是指使用濃度大于30mg/L的無機元素，有氮、硫、磷、鉀、鎂、鈣、氯、鈉。微量元素是指使用濃度低于30mg/L的無機元素，如鐵、錳、碘、鉬、銅、鋅等。磷的消耗很快，但機體自身可產(chǎn)生磷可滿足需要；氮常以銨鹽或硝酸鹽形式提供。鉀、鎂、鈣離子對細胞代謝必不可少，鎂離子參與多種輔酶和激活子的合成；鉀離子、鈣離子可抑制某些酶的活性，有時鈣離子也可保持某些酶的活性或穩(wěn)定性。微量元素的作用是參與輔因子的形成，并可誘導酶的合成。

（2）碳源

植物細胞培養(yǎng)物通常為異養(yǎng)細胞，常用的碳源為碳水化合物、肌醇、甘油、乳糖和半乳糖等。天然提取物（如椰子乳）對愈傷組織的誘導和培養(yǎng)也有重要意義。（3）植物生長調(diào)節(jié)劑植物激素是植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（小于1μmol/L）時，即能調(diào)節(jié)植物的生長、發(fā)育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運到作用部位而發(fā)揮作用。常見的5種植物激素：生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯。愈傷組織或培養(yǎng)細胞的生長和生存依賴于合成的生長素或天然生長素，生長素可誘導特異酶類。植物組織和細胞培養(yǎng)物的生長過程主要取決于生長素和分裂素的比例，比值高可刺激細胞分裂；比值低則刺激細胞生長。對于植物培養(yǎng)細胞，絕大多數(shù)培養(yǎng)基中都必須加入一定量的植物生長調(diào)節(jié)劑。

（4）有機氮源

常用蛋白質(zhì)水解物或各種氨基酸。有機氮源對細胞的早期生長有利，氨基酸的加入是為了代替或增加氮源的供應。

（5）維生素

植物細胞通常是維生素自養(yǎng)型，但大多數(shù)情況下，其合成的量不能滿足需要，需加入B族維生素，以及生物素和肌醇。

二、培養(yǎng)方法按培養(yǎng)對象：原生質(zhì)體培養(yǎng)和單倍體細胞培養(yǎng)；按培養(yǎng)基類型：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式：懸浮培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。固體培養(yǎng)包括瓊脂培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)。優(yōu)點：簡便易行、所占空間小。缺點：①外植體或愈傷組織僅有一部分與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)基中產(chǎn)生濃度差，愈傷組織生長不平衡；②外植體基部插入培養(yǎng)基中，該處氣體交換不暢，阻礙了組織呼吸正常進行，會堆積生長過程中的有害物質(zhì)；③在愈傷組織細胞間出現(xiàn)極化現(xiàn)象，導致細胞群體不均一；④固體培養(yǎng)物有時要測定一些生理生化指標，還需轉(zhuǎn)入液體。植物細胞的培養(yǎng)溫度為25℃左右，常需光照，光照以每天16h為宜，一般用日光燈照射。由于植物組織在培養(yǎng)基上生長時要不斷消耗養(yǎng)分、散失水分和累積代謝產(chǎn)物，因此外植體在培養(yǎng)3周左右必須移至新鮮培養(yǎng)基上，以保持繼續(xù)生長。移換一次培養(yǎng)基成為一次繼代培養(yǎng)，經(jīng)過一定次數(shù)的繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)物可用于懸浮培養(yǎng)。液體培養(yǎng)系統(tǒng)包括小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模的成批培養(yǎng)、半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)有靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩類。1、成批培養(yǎng)法

將培養(yǎng)基一次性加入反應器中，接種、培養(yǎng)一定時間后收獲細胞的操作方式。最適于植物細胞培養(yǎng)的是氣升式反應器。根據(jù)次級代謝產(chǎn)物的大量積累一般發(fā)生在細胞生長的穩(wěn)定期，植物細胞采用兩步培養(yǎng)法，使用兩個反應器：第一個用于細胞生物量的累積，第二個用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。2、半連續(xù)培養(yǎng)法

在反應器中投料和接種培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)基進行交換的培養(yǎng)方法。

3、連續(xù)培養(yǎng)法

利用連續(xù)培養(yǎng)反應器，在投料和接種一段時間后，以一定的速度連續(xù)采集細胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細胞生長環(huán)境維持恒定的方法。4、固定化培養(yǎng)法

固定化反應器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中空纖維膜等多種類型。將細胞固定在尼龍網(wǎng)套內(nèi)或固定于中空纖維膜反應器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板上，放入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，或連續(xù)通入新鮮培養(yǎng)基，進行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集細胞；也可通入凈化空氣代替攪拌。固定化的優(yōu)點是細胞位置固定，易于獲得高密度細胞群體和維持細胞間的物理化學梯度，利于細胞組織化，易于控制培養(yǎng)條件及獲得次級代謝產(chǎn)物。三、影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素影響次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和累積的因素主要有：①生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；②物理條件：溫度、光（光照時間、光強、光質(zhì)）、通氣（氧氣）、pH和滲透壓；③化學條件：無機鹽、碳源、植物生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)和前體等；④工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌和培養(yǎng)方式等。1、外植體的選擇

不同外植體的懸浮培養(yǎng)物，其最大次級代謝產(chǎn)物的積累時間不同。同一化合物可以在不同外植體的不同生長階段累積。

2、培養(yǎng)條件的影響

培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素：營養(yǎng)成分、生物及非生物元素、pH、通氣以混合程度、與接種有關的因素。外部因素：剪切力、攪拌頻率、溫度和光等。（1）培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素

①接種和誘導

外植體的大小直接影響所誘導的組織和細胞的生長，而且也關系到其次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。外植體的前處理也可嚴重影響次級代謝產(chǎn)物的累積方式。②培養(yǎng)基的組成基本培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮細胞培養(yǎng)的物質(zhì)基礎。磷：低磷會導致次級代謝產(chǎn)物的累積，缺乏磷會導致生物量的大幅度降低。氮：有些植物可利用硝酸鹽作為第一氮源；有些則利用銨鹽作為第一氮源；有些需要兩種氮源；有的需要特殊的有機氮源。如天冬氨酸