不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠泌尿生殖系統(tǒng)的影響

目錄不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠泌尿生殖系統(tǒng)的影響目錄摘要 [33]。研究表明，黃甜竹、綠竹、毛竹、苦竹等的提取物都具有很好的抗氧化作用，能有效的清除機體自由基[34]。不同地區(qū)不同種類的竹葉在不同季節(jié)黃酮含量存在差異[35]。竹葉提取物在小鼠抗衰老試驗中，能有效的提高過氧化物歧化酶的活性，降低內(nèi)脂質(zhì)過氧化，在體外試驗中能很好的清除自由基，表現(xiàn)出有效的抗氧化能力[36]。不同竹種的竹葉提取物抗氧化功效表現(xiàn)出明顯的不同，但都具有能抑制機體氧化應(yīng)激反應(yīng)的效果。1.1.2竹葉提取物抗炎抑菌作用大量研究表明，竹葉提取物對常見的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有很好的抑制效果[23]?？咕鷮嶒灡砻鞑煌穹N不同季節(jié)的竹葉提取物抑菌效果都不一樣[37]。在小鼠氣囊滑膜炎試驗中，竹葉提取物對該炎癥有抑制作用，表現(xiàn)出抗炎效果[38]。研究表明，竹葉提取物主要成分黃酮類化合物能刺激機體免疫細(xì)胞的的應(yīng)答反應(yīng)，促進增殖分化，分泌抗體，加強機體對炎癥反應(yīng)的抵抗[39]。對家禽生產(chǎn)性能的研究中發(fā)現(xiàn)，竹葉提取物能促進胸腺和法氏囊的發(fā)育，提高機體的免疫能力。1.2冷應(yīng)激1.2.1冷應(yīng)激對生物的影響動植物的生存都離不開一定的環(huán)境溫度，舒適的溫度能夠使個體更好的生長發(fā)育和繁殖。環(huán)境溫度的改變是一個很重要的環(huán)境應(yīng)激因素[40,41]。因此，環(huán)境溫度直接影響著動物植物的生存狀態(tài)。就人而言，長期處于冷應(yīng)激環(huán)境中，機體穩(wěn)態(tài)必然紊亂，出現(xiàn)各種不適癥狀，體溫逐漸降低，慢慢喪失感覺[42]，嚴(yán)重者便會威脅到生命。寒冷環(huán)境主要出現(xiàn)在冬季和高緯度地區(qū)，能存活在該條件下的生物必然具有很強的適應(yīng)能力，從覓食策略到生活習(xí)性都能完美的契合生存條件，才不至于被寒冷環(huán)境淘汰。1.2.2冷應(yīng)激對動物各組織的影響應(yīng)激是機體受內(nèi)外環(huán)境刺激所引起的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變的一種狀態(tài)。應(yīng)激根據(jù)應(yīng)激源的不同分為冷應(yīng)激、熱應(yīng)激以及運輸應(yīng)激等，其中對野生動物而言最常見的是以溫度變化所引起的冷熱應(yīng)激，也是影響野生動物生活的主要因素。由寒冷刺激引起的冷應(yīng)激可根據(jù)應(yīng)激持續(xù)時間分為急性冷應(yīng)激和慢性冷應(yīng)激，其中急性冷應(yīng)激是指機體短時間內(nèi)處于低溫環(huán)境；慢性冷應(yīng)激通常是由于季節(jié)變化導(dǎo)致機體長時間處于低溫環(huán)境中，導(dǎo)機體感覺神經(jīng)核運動神經(jīng)受到抑制，甚至可能發(fā)生不可逆損傷[43]。相關(guān)研究表明冷應(yīng)激可引起炎癥因子水平的上調(diào)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而引起組織的炎性損傷。炎癥反應(yīng)是一種病理過程，是機體對刺激的一種防御性反應(yīng)。Fu等發(fā)現(xiàn)12℃的冷應(yīng)激可增加鵪鶉腸道NF-κB的mRNA表達量，引發(fā)炎癥反應(yīng)[44]。6-8℃環(huán)境中連續(xù)冷應(yīng)激3周可導(dǎo)致大鼠腸道上皮細(xì)胞增值率受損，誘導(dǎo)小腸發(fā)炎[45]。小鼠在4℃寒冷環(huán)境中冷應(yīng)激2周后，也會發(fā)生炎癥反應(yīng)[46]。肉雞在12℃冷應(yīng)激條件下會導(dǎo)致肝臟組織的炎性損傷[47]。此外，冷應(yīng)激還可以一起組織結(jié)構(gòu)的病理學(xué)改變，導(dǎo)致組織的形態(tài)學(xué)損傷。李瑞綱等研究發(fā)現(xiàn)，昆明系小鼠每天在4℃環(huán)境中冷應(yīng)激1h，連續(xù)30天后，其胃粘膜和腎上腺皮質(zhì)區(qū)均出現(xiàn)出血點[48]。4℃和-12℃的寒冷刺激可以引起9-15周齡雄性SD大鼠的脾臟形態(tài)學(xué)損傷，表現(xiàn)為白髓萎縮，淋巴小結(jié)減少[49]。在對肉雞的研究中還發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激可引起十二指腸組織的細(xì)胞核染色質(zhì)邊集、線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，甚至出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[50]?？梢悦黠@看出，冷應(yīng)激會對動物機體產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重則可導(dǎo)致各組織出現(xiàn)不同程度的病理性損傷。冷應(yīng)激對動物機體有著廣泛且復(fù)雜的影響，就生產(chǎn)動物而言可以直接影響其生產(chǎn)性能、繁殖性能及產(chǎn)品質(zhì)量，也會導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率上升[51,52]。有研究表明，冷應(yīng)激可以對雞、鵝[53]、鷓鴣[54]、豬[55]、牛[56]、羊[57]、小鼠[58]和大鼠[59]等的腸道、血清酶活力、精子活力、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞核基因產(chǎn)生不同程度的影響，導(dǎo)致動物的生長、發(fā)育、繁殖、生活、行為等方面的異常狀態(tài)[60]，還會導(dǎo)致性發(fā)育遲緩、血液指標(biāo)和代謝指標(biāo)等不良反應(yīng)，甚至在冷刺激達到一定程度時會致使動物發(fā)生關(guān)節(jié)炎、凍傷、腸炎、腹瀉和肺炎等疾病，嚴(yán)重者直接導(dǎo)致動物死亡[61]。1.2.3冷應(yīng)激對動物生殖器官的影響冷應(yīng)激對生殖系統(tǒng)也有影響。動物實驗顯示，雄性長期暴露于冷環(huán)境中，其精子密度、精子活動率等顯著下降，此外，D級精子比率顯著上升，不僅如此，還會對精子的產(chǎn)生速度，睪丸中精子形態(tài)造成嚴(yán)重的影響[62]。低溫對雄性大鼠有明顯的抗生育效果[63]。雌性SD大鼠在冷應(yīng)激兩周后，健康的竇前卵泡、原始卵泡和初級卵泡的出現(xiàn)減少[64]。慢性冷應(yīng)激能夠引起卵泡發(fā)育改變而引起生殖損傷[65]。冷應(yīng)激強度和冷應(yīng)激頻率對大鼠卵巢的黃體細(xì)胞與顆粒細(xì)胞分泌孕酮的能力也有影響[66]。持續(xù)冷應(yīng)激可激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，通過影響下丘腦-垂體-性腺軸，使得雌性大鼠卵巢子宮發(fā)育延遲，卵巢重量、子宮重量及血清雌二醇水平顯著下降，這些將進一步加重對生殖系統(tǒng)的影響。1.2.4冷應(yīng)激對生育能力的影響實驗顯示，母兔在發(fā)情期時如突遇寒冷天氣，或者引用過量冰水，吃了過冷飼料，都會引起生殖器官的血液循環(huán)障礙而引起不孕[67]。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)將雌性果蠅在放置4℃條件下慢性冷應(yīng)激3天，發(fā)現(xiàn)寒冷對其生育能力有重大影響，子代果蠅的出生率以及子代果蠅的體型明顯降低，但機制尚不明確。有學(xué)者便提出雌性果蠅能夠通過降低生育能力來提高耐寒能力，長期低溫導(dǎo)致生育能力受到影響，但在冬季結(jié)時生殖能力便開始恢復(fù)。以上研究都說明冷應(yīng)激動物的生殖能力有著明顯的影響。1.3研究目的及意義秦嶺佛坪冬季和春季持續(xù)時間長，從11月開始可持續(xù)到來年3月[68]，該地區(qū)的大熊貓在此期間都生活在低溫環(huán)境下，其主食竹為巴山木竹，且基本上只采食竹葉。大熊貓在此期間可能因為寒冷脅迫，需要大量能量而對機體能量進行重新分配，在滿足基本需求的前提下再考慮繁殖的問題。能量來源的唯一路徑便是采食，通過大量采食的方式來滿足在寒冷環(huán)境中的高能量需求。在長期的進化過程中，大熊已特化為以竹為主要食物來源的食肉目動物，目前大量研究發(fā)現(xiàn)，食草動物在面對一系列的外界環(huán)境中生物和非生物因素改變時，會優(yōu)化覓食策略[69-71]，那么大熊貓在冬季的覓食策略是否與非生物因素寒冷有關(guān)？大熊貓在大量采食巴山木竹葉的過程中，獲取了大量的營養(yǎng)物質(zhì)的滿足自身能量需求的同時也攝入了大量的植物次生代謝產(chǎn)物。本課題組前期對佛坪大熊貓冬季取食區(qū)和非取食區(qū)巴山竹葉提取物的化學(xué)成分進行了比較分析，在采食區(qū)發(fā)現(xiàn)了多種具有獨特生物活性的生物堿和黃酮類化合物，并通過體外實驗進一步驗證了佛坪大熊貓主食巴山竹葉提取物的抗氧化活性[67]。由于體內(nèi)試驗與體外試驗差異性的存在，且大熊貓為國家級保護動物，無法回歸動物實驗。因此，選擇模式動物昆明小鼠為試驗動物，欲通過巴山木竹葉提取物對動物生理活性的研究，驗證竹葉提取物對雌性動物在低溫環(huán)境下泌尿生殖系統(tǒng)的一個抗應(yīng)激作用，說明長期處于低溫環(huán)境下的動物，在攝取一定量的竹葉提取物后能對機體產(chǎn)生的不適應(yīng)情況能起到抑制機體損傷的作用，并對雌性動物的繁殖能力具有維持作用。以此來推測長期處于寒冷環(huán)境中大熊貓大量采食巴山木竹葉可能的原因，為進一步探究野外大熊貓在面對生物和非生物脅迫時的最優(yōu)覓食策略是否與與竹葉中植物次生代謝產(chǎn)物(Plantsecondarymetabolites，PSMs)有關(guān)，對大熊貓的保護研究提供一種可能性。1.4研究內(nèi)容及技術(shù)路線1.4.1研究內(nèi)容本研究使用雌性昆明小鼠進行BLE體內(nèi)試驗，通過在不同溫度和灌胃BLE梯度水平條件下，對臟器系數(shù)，血清和組織抗氧化，血清免疫指標(biāo)以及血清雌二醇的檢測結(jié)果推斷出小鼠的最適灌胃劑量。在建立不同環(huán)境溫度下灌注BLE實驗方法學(xué)的基礎(chǔ)上，研究不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠泌尿生殖系統(tǒng)的影響。通過觀察組織病理學(xué)切片來初步探究溫度與BLE對否對小鼠泌尿生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響甚至造成病理損傷。在通過流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測腎臟細(xì)胞凋亡率來探究溫度與BLE對細(xì)胞凋亡造成的影響，以此來初探其作用機制。1.4.2技術(shù)路線圖1-1技術(shù)路線Fig.1-1Technicalroute

第2章不同環(huán)境溫度下灌注BLE實驗方法學(xué)的建立第2章不同環(huán)境溫度下灌注BLE實驗方法學(xué)的建立2.1材料與方法2.1.1主要儀器及試劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司RV10型；脂肪測定儀：青島海能儀器有限公司SOX500型；電子分析天平：德國Sartorius公司；電熱鼓風(fēng)干燥機：上海一恒科學(xué)儀器有限公司DHG-9240A型；恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司KD-98-IIA型；乙酸乙酯（Ethylacetate，分析純），成都科龍公司；巴山木竹葉提取物：實驗室自備。巴山木竹葉提取物混懸液：稱取適量竹葉提取物干膏，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成竹葉提取物混懸液。巴山木竹葉提取物干膏由實驗室自備，提取方法為實驗室前人所得[72]。2.1.2竹葉提取物的制備樣品預(yù)處理：野外采集成熟綠色巴山木竹葉，在實驗室洗凈后自然烘干，再放入磁盤中，烘干至恒重。最后將巴山木竹葉樣品粉碎，粉碎后過60目篩，密封低溫保存。竹葉提取物（Bambooleafextract，BLE）的制備：使用電子天平準(zhǔn)確稱取20.00±0.01g樣品，用濾紙包成規(guī)則的矩形，確保折疊規(guī)整，防止粉末樣漏出。將濾紙包放入潔凈的樣品罐中，向樣品罐中加入乙酸乙酯直至沒過濾紙包，靜置過夜。過夜后，將樣品罐中的樣品及浸出液都放入脂肪測定儀的抽提管中，進行索式熱萃取，不斷循環(huán)直至抽提管中液體無色透明，萃取完成。將全部萃取液減壓過濾后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮（60±2℃，450mbar），直至成為干膏狀。匯總所有干膏并記錄后，密封避光低溫保存[72]。2.1.3實驗動物本研究以7周齡SPF級（specificpathogenfree，SPF）健康雌性昆明小鼠60只（體重為18~22g左右）為研究對象，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。2.2動物分組及方法預(yù)飼一周后，將小鼠隨機分為5組，分別為常溫對照組（Normaltemperature+controlgroup）：NT+CON、低溫對照組（Lowtemperature+controlgroup）：LT+CON、低溫低劑量組（Lowtemperature+lowdosebambooleavesextractgroup）：LT+LBLE（340mg/kg）、低溫中劑量組（Lowtemperature+mediumdosebambooleavesextractgroup）：LT+MBLE（680mg/kg）、低溫高劑量組（Lowtemperature+highdosebambooleavesextractgroup）：LT+HBLE（1020mg/kg）每組12只，分籠飼養(yǎng)。采用灌胃方式給藥，藥物實驗開始后，各組小鼠于每日早8：00稱重、灌胃，自由飲水。劑量組，將竹葉提取物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成相應(yīng)的濃度竹葉提取物混懸液，每只小鼠每天按0.02mL/g進行灌胃，常溫與低溫對照組則灌胃等劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。從實驗開始時，常溫組一直置于25℃，低溫各組每天10:00至12:00置于4℃寒冷環(huán)境2個小時，連續(xù)14d。2.2.1樣本采集雌性小鼠實驗周期結(jié)束后，使用摘眼球采血方法采集1mL左右的新鮮血液于2mL無菌離心管中。室溫靜置30min后，在高速冷凍離心機（MultifugeX1R，ThermoFisher）中4000r/min4℃離心15min，離心結(jié)束后立即分離血清，將血清裝入2mL無菌離心管中，做好標(biāo)記，低溫保存，用于后續(xù)指標(biāo)檢測。采用頸椎脫臼法處死小鼠后，立即打開小鼠腹腔，取出新鮮肝臟樣品，放于-20℃冷凍保存，用于后續(xù)指標(biāo)檢測。2.2.2檢測指標(biāo)與方法2.2.2.1臟器系數(shù)測定采集樣本前對小鼠進行稱重，摘眼球采血后，立即打開小鼠腹腔，及時剝離肝臟、腎臟、脾臟以及卵巢，使用電子分析天平稱量組織濕重，并計算臟器系數(shù)[73]。organcoefficients2.2.2.2血清中SOD檢測酶標(biāo)儀檢測血清中SOD的變化情況，取待測血清用生理鹽水稀釋成不同濃度進行預(yù)實驗，選取出適宜濃度后使用南京建成試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。2.2.2.3肝臟中SOD及MDA檢測準(zhǔn)確稱取0.2g肝臟組織，按照重量與體積之比為1:9的比例加入9倍體積的生理鹽水，將組織在勻漿機中充分勻漿，制備成10%的肝組織勻漿，2500~300r/min，離心10min，取上清即10%勻漿上清液待測。均使用酶標(biāo)儀檢測SOD和MDA的變化情況，使用南京建成試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作具體操作參照試劑盒說明書。2.2.2.4血清中IL-2、IFN-γ檢測酶標(biāo)儀檢測血清中IL-2、IFN-γ的變化情況，使用聯(lián)科生物試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。2.2.2.5血清中雌二醇檢測酶標(biāo)儀檢測血清中雌二醇的變化情況，使用南京建成試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作具體操作參照試劑盒說明書。2.2.2.6數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)使用Excel2016進行整理，并用SPSS22.0中的ANOVA方法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，其中P<0.01為差異極顯著，以P<0.05為差異顯著，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（X?±SE）表示。2.3實驗結(jié)果2.3.1臟器系數(shù)檢測結(jié)果低溫和灌注BLE對小鼠內(nèi)臟的臟器系數(shù)變化見表2-1。由表2-1可知，溫度會導(dǎo)致小鼠肝臟、脾臟、腎臟的臟器系數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢，但差異不顯著（P>0.05），在不同溫度下灌注不同BLE濃度各臟器系數(shù)均無顯著性差異（P>0.05）。從變化規(guī)律上看，就肝臟而言，LT+HBLE組最接近NT+CON組；就脾臟而言，LT+LBLE組最接近NT+CON組；就腎臟而言，LT+LBLE組最接近NT+CON組?？傮w上LT+LBLE組的各臟器系數(shù)最接近于NT+CON組。表2-1小鼠臟器系數(shù)Table2-1Organcoefficientofmice項目=（12）組別/GroupNT+CONLT+CONLT+LBLELT+MBLELT+HBLE肝臟（mg/g）47.89±5.6241.38±3.0841.74±5.0842.93±4.7046.42±7.63脾臟（mg/g）2.26±0.502.40±0.812.26±0.392.25±0.252.09±0.44腎臟（mg/g）11.40±0.8310.36±0.8210.95±0.9810.76±0.9010.85±1.332.3.2血清中SOD及肝臟中SOD、MDA結(jié)果由表2-2可知，溫度會引起小鼠血清中SOD含量下降，肝臟中SOD含量下降，MDA含量上升，但差異都不顯著（P>0.05）。同一溫度下灌注不同BLE，血清中SOD含量呈下降趨勢，差異均不顯著（P>0.05），肝臟中SOD含量LT+MBLE組和LT+HBLE明顯低于LT+LBLE組，且LT+MBLE組和LT+HBLE組與NT+CON之間存在顯著性差異（P<0.05），LT+LBLE組與NT+CON組之間無顯著性差異；肝臟中MDA含量變化為，LT+MBLE組和LT+HBLE組中均高于LT+LBLE組，但無顯著性差異。表2-2小鼠血清中SOD含量及肝臟中SOD、MDA含量Table2-2SODcontentinserumandSOD,MDAcontentinliverofmice項目=（12）組別/GroupNT+CONLT+CONLT+LBLELT+MBLELT+HBLE血清SOD73.26±4.1872.64±4.3572.45±4.0669.88±5.5871.32±5.04肝臟SOD528.92±84.84a438.74±89.74ab487.21±25.12ab406.71±14.10b401.82±36.76b肝臟MDA2.44±0.712.66±0.672.46±0.623.28±0.722.73±0.682.3.3血清中IL-2、IFN-γ結(jié)果血清中IL-2、IFN-γ的檢測結(jié)果見表2-3，由表2-3可知，不同溫度下血清中IL-2含量有差異，但是不顯著。灌注不同BLE條件下，LT+MBLE組和LT+HBLE組血清中IL-2含量明顯高于LT+LBLE組與NT+CON組。不同溫度下血清中IFN-γ含量變化為，低溫組顯著低于常溫組（P<0.05），但不同灌注濃度下的IFN-γ含量變化不顯著，但LT+LBLE組含量最低。表2-3小鼠血清中IL-2、IFN-γTable2-3IL-2,IFN-γinmouseserum項目=（12）組別/GroupNT+CONLT+CONLT+LBLELT+MBLELT+HBLEIL-2（pg/ml）1.85±1.031.25±0.581.27±0.801.66±0.911.98±0.50IFN-γ（pg/ml）10.38±3.95a5.74±2.39b2.78±2.55b5.57±3.38b6.22±3.44b2.3.4血清中雌二醇結(jié)果由表2-4可知，不用溫度下小鼠雌二醇激素含量變化不顯著，在不同灌注濃度下，LT+LBLE組與LT+CON組和LT+MBLE組之間存在顯著性差異（P<0.05），LT+HBLE組與LT+CON組之間存在差異性。從灌注組總體變化趨勢來看，劑量組雌二醇激素含量均低于無劑量組。表2-4小鼠血清中雌二醇檢測結(jié)果Table2-4Detectionofestradiolinmouseserum組別/GroupNT+CONLT+CONLT+LBLELT+MBLELT+HBLE雌二醇109.32±18.22ab120.28±14.58a86.58±24.50bc115.04±13.96a73.52±8.94c2.4討論2.4.1不同環(huán)境溫度下灌注BLE對小鼠臟器系數(shù)的影響臟器系數(shù)是指實驗動物中的某個器官的重量與其體重的比值，又稱臟體比。臟器系數(shù)是毒理實驗中常用的指標(biāo)，常用于反應(yīng)某器官的變化，是生理和病理變化的重要指標(biāo)[74]。臟器系數(shù)增大，可能的原因有肥大、水腫、充血等；臟器系數(shù)減小，可能的原因有器官退化或者收縮等原因。將取出的肝臟、腎臟、脾臟組織進行了及時稱量，并計算出了臟器系數(shù)。從實驗結(jié)果來看，各組織之間有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義。單從數(shù)值上看，就溫度而言，低溫組臟器系數(shù)低于常溫組，低溫組中，其中灌注BLE組中的LT+LBLE組各器官臟器系數(shù)最接近常溫組。因此，推測，低溫環(huán)境下肝臟、腎臟和脾臟的臟器系數(shù)變化不明顯的原因可能是低溫處理時間較短。但從低溫灌注情況下看，灌注中高濃度的BLE臟器系數(shù)變化比灌注低濃度的BLE明顯，低濃度組的數(shù)值最接近常溫組和低溫?zé)o劑量組，低溫中劑量和高劑量組都偏離低溫?zé)o劑量組和常溫組較遠(yuǎn)。綜上所述，低溫低劑量組是最灌注最理想劑量。2.4.2不同環(huán)境溫度下灌注BLE對小鼠血清中SOD和肝臟中SOD、MDA的影響研究表明，低溫會引起機體的能量變化，導(dǎo)致發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。環(huán)境溫度的改變產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)能引發(fā)機體的抗氧化系統(tǒng)失衡，致使氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[75]。機體的抗氧化能力可以通過SOD和MDA的活性變化反應(yīng)出。其中MDA是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，是細(xì)胞損傷的指標(biāo)之一，而SOD能夠維持氧化平衡[76]，是抗氧化產(chǎn)物，能夠抑制MDA形成并消除自由基。對于血清中SOD含量的變化趨勢來看，低溫環(huán)境下，SOD下降，說明低溫造成的應(yīng)激反應(yīng)使小鼠的氧化動態(tài)平衡發(fā)生了變化。對于肝臟中SOD的變化情況來看，不同溫度下，低溫環(huán)境與常溫環(huán)境中存在顯著性差異，說明對于肝臟組織而言，應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致了氧化動態(tài)平衡的破壞；灌注低劑量組與常溫組之間無顯著性差異，說明灌注BLE能致使SOD含量上升，維持機體平衡狀態(tài)。對于肝臟中MDA的變化情況來看，低溫組均高于常溫組，說明MDA含量上升，就灌注組而言，低劑量組明顯低于中劑量組和高劑量組且低于低溫對照組，說明在低溫條件下灌注BLE可以減少MDA的含量，減少對機體的氧化損傷，且低劑量組作用最明顯。2.4.1不同環(huán)境溫度下灌注BLE對小鼠免疫因子的影響細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，細(xì)胞因子水平可以衡量免疫功能的高低。炎癥相關(guān)因子的表達量的減少可以減少機體的損傷。IFN-γ和IL-2可以直接介導(dǎo)細(xì)胞免疫。結(jié)果表明，不同溫度環(huán)境下，低溫組免疫因子都低于常溫組，且灌注低劑量組中免疫因子水平最低，說明機體免疫應(yīng)答相較于無劑量組、中劑量組和高劑量組都低。在發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)的情況下，灌注BLE能減少機體損傷情況，從而減少機體免疫應(yīng)答。因此，灌注低劑量的BLE能減少機體炎癥的發(fā)生。第3章不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠泌尿生殖系統(tǒng)的影響第3章不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠泌尿生殖系統(tǒng)的影響3.1材料與方法3.1.1試驗材料巴山木竹葉提取物混懸液的制備：巴山木竹葉提取物制備方法同第2章2.1.2。稱取適量竹葉提取物干膏，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成竹葉提取物混懸液。3.1.2試驗動物240只雌性SPF級昆明小鼠，6-8周齡，體重18-22g，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。3.1.2主要儀器和試劑主要儀器和試劑見表3-1。表3-1主要儀器與試劑Table3-1Maininstrumentsandreagents實驗儀器與試劑Experimentalinstrumentsandreagents生產(chǎn)廠家Producer流式細(xì)胞儀（CytoFLEX）Backman（美國）eBioscienceTMAnnexinV-FITCApopKit300tests（BMS500fi-300）Invitrogen（澳大利亞）光學(xué)顯微鏡（CX22）OLMPUS（日本）徠卡顯微成像系統(tǒng)（DM1000）Leica（德國）蘇木素ThermoFisher（美國）伊紅ThermoFisher（美國）多聚甲醛成都市科隆化學(xué)品有限公司（中國）乙醇成都市科隆化學(xué)品有限公司（中國）二甲苯成都市科隆化學(xué)品有限公司（中國）3.2試驗方法240只雌性昆明小鼠，預(yù)飼養(yǎng)一周，使用完全隨機法，按照2×2設(shè)計，即溫度（25℃、4℃）與灌胃劑量（0、340mg/kg）進行二水平因子設(shè)計，將240只雌性昆明小鼠分為4組：常溫對照組：（Normaltemperature+controlgroup）：NT+CON；常溫竹葉提取物組：（Normaltemperature+bambooleavesextractgroup）：NT+BLE；低溫對照組：（Lowtemperature+Controlgroup）：LT+CON；低溫竹葉提取物組：（Lowtemperature+bambooleavesextractgroup）：LT+BLE，飼養(yǎng)28d，并于14d、28d兩個時間點進行采樣。采用灌胃方式給藥，藥物實驗開始后，各組小鼠于每日早8：00稱重、灌胃，自由飲水。常溫與冷應(yīng)激實驗組，將竹葉提取物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成相應(yīng)的濃度，每只小鼠每天按0.02mL/g進行灌胃，常溫與冷應(yīng)激對照組則灌胃等劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。從實驗開始時，常溫組一直置于25℃，冷應(yīng)激各組每天于10:00時候至14:00時候,置于4℃寒冷環(huán)境4個小時，連續(xù)28d。在飼養(yǎng)14d和第28d后采集樣本。3.2.1卵巢病理組織學(xué)觀察處死小鼠后及時剝離卵巢組織，均采集小鼠右側(cè)卵巢，按照如下步驟進行檢測：1）包埋：采用4%多聚甲醛固定的卵巢組織，將及時分離的卵巢經(jīng)流水沖洗30min后，剝離周圍結(jié)締組織，再放入病理包埋塑料筐中進行脫水（75%乙醇6h，85%乙醇10h，95%乙醇4h，無水乙醇Ⅰ2h，無水乙醇Ⅱ2h），透明（二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ15min），浸蠟3h，最后包埋卵巢組織塊于石蠟中。2）切片：采用LeicaRM2235切片機將卵巢切成5μm厚的薄片，在溫水中將組織展平后撈在載玻片上，60℃烘烤切片至少2h。3）染色：烘烤后的切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，流水洗滌20min，再用蘇木素染色30min，染色結(jié)束后流水洗滌20min，鹽酸酒精分化，伊紅染色5min，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明后用樹脂膠封片。4）觀察：顯微鏡下觀察卵巢病理學(xué)變化，完整地瀏覽整張組織片，對正常組織或有明顯病變部位均采用顯微成像系統(tǒng)拍照記錄。5）記錄結(jié)果3.2.2腎臟病理組織學(xué)觀察處死小鼠后及時剝離腎臟組織，均采集小鼠右腎，檢測步驟同第3章3.2.13.2.3不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率的檢測取腎臟組織剪碎后，經(jīng)300目濾布過濾，250g離心5min，滴管吹掉組織細(xì)胞碎片，用PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為106個/ml。再取100ul濃度為106個/ml的單細(xì)胞懸液，250g離心5min，棄去上清。之后加入新鮮配置的1X結(jié)合緩沖液200μL重懸細(xì)胞。在加入5ul的AnnexinV-FITC染色熒光染料染色10min，室溫避光。加入10ul的PI染色5min，室溫避光。加400μL結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，立即上機檢測。使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測，采用Kaluza2.1軟件對數(shù)據(jù)進行分析。3.3數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)使用Excel2010進行整理，并用SPSS20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用雙因素分析（UNIANOVA）將溫度和劑量兩種因素進行比較，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（X±SE）表示，記作p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著3.4試驗結(jié)果3.4.1卵巢病理組織學(xué)觀察結(jié)果如下圖所示，14d時，NT+CON組小鼠卵巢組織中各級卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，黃體等結(jié)構(gòu)清晰，組織細(xì)胞排列整齊，未見明顯的病理學(xué)損傷（圖3-1a）；NT+BLE組中卵巢中各級結(jié)構(gòu)均正常，未出現(xiàn)明顯病理學(xué)變化，也未見明顯形態(tài)學(xué)改變（圖3-1b）；NT+CON組小鼠卵巢組織中各組織細(xì)胞排列整齊，沒有明顯病理學(xué)變化，但存在卵巢內(nèi)出血現(xiàn)象（圖3-1c）；LT+BLE組卵巢組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯組織病理損傷，也未見出血或者充血現(xiàn)象（圖3-1d）。28d時，NT+CON組、NT+BLE組、LT+CON組和LT+BLE組中卵巢組織結(jié)構(gòu)夠正常，均未見明顯的病理學(xué)變化，也未見明顯的形態(tài)學(xué)改變（圖3-2a，圖3-2b，圖3-2c，圖3-2d）圖3-1a（NT+CON）：卵巢各結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理損傷。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-1a（NT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.圖3-1b（NT+BLE）：卵巢未見明顯病理損傷。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-1b（NT+BLE）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.圖3-1c（LT+CON）：卵巢組織內(nèi)見出血現(xiàn)象。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-1c（LT+CON）:theOvariantissuewasbleeding.HE,Bar=50μm,200×.圖3-1d（LT+BLE）：卵巢未見明顯病理損傷。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-1d（LT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.圖3-114d不同環(huán)境溫度下灌注BLE小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)Figure3-1theOvariantissuestructureofBLEmiceperfusedunderdifferentenvironmentaltemperaturesat14d圖3-2a（NT+CON）：卵巢各結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理損傷。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-2a（NT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.圖3-2b（NT+BLE）：卵巢未見明顯病理損傷。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-2b（NT+BLE）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.圖3-2c（LT+CON）：卵巢未見明顯病理損傷。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-2c（LT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.圖3-2d（LT+BLE）：卵巢未見明顯病理損傷。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-2d（LT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.圖3-228d不同環(huán)境溫度下灌注BLE小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)Figure3-2theOvariantissuestructureofBLEmiceperfusedunderdifferentenvironmentaltemperaturesat28d3.4.2腎臟病理組織學(xué)觀察結(jié)果如下圖所示，14d時，NT+CON組小鼠腎臟組織中腎小球腎小管組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，界限清晰，未見有明顯組織病理損傷（圖3-3a）。NT+BLE組腎臟組織中各細(xì)胞結(jié)構(gòu)均正常，未出現(xiàn)明顯病理學(xué)變化（圖3-3b）；LT+CON組小鼠腎臟組織中出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞腫脹顆粒變性，管腔內(nèi)見嗜伊紅蛋白沉積現(xiàn)象（圖3-3c），LT+BLE組腎臟組織中腎小球和腎間質(zhì)毛細(xì)血管擴張充血，腎小囊內(nèi)見少量絲網(wǎng)狀嗜伊紅蛋白沉積（圖3-3d）。28d時，NT+CON組腎臟組織結(jié)構(gòu)夠完整，未見明顯的病理學(xué)變化（圖3-4a），NT+BLE組腎臟組織細(xì)胞中腎小管上皮細(xì)胞腫脹，顆粒變性（圖3-4b），LT+CON組腎小管上皮細(xì)胞腫脹呈空泡狀，且此狀態(tài)細(xì)胞數(shù)目較多（圖3-4c），LT+BLE組中腎小管上皮細(xì)胞腫脹程度較輕，且此狀態(tài)細(xì)胞數(shù)目相對較少（圖3-4d）。圖3-3a（NT+CON）：腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，界線清晰，未見有明顯組織病理損傷。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-3a（NT+CON）:Therenaltissuestructureisnormal,thecellsarearrangedorderly,theboundaryisclear,andthereisnoobvioushistopathologicaldamage.HE,Bar=50μm,200×.圖3-3b（NT+BLE）：腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理損傷。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-3b（NT+BLE）:theKidneytissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.圖3-3c（LT+CON）：腎小管上皮細(xì)胞腫脹顆粒變性，管腔內(nèi)見嗜伊紅蛋白沉積。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-3c（LT+CON）:Swellingandgranulardegenerationofrenaltubularepithelialcells,eosinophilicproteindepositioninthelumen.HE,Bar=50μm,200×.圖3-3d（LT+BLE）：腎小球和腎間質(zhì)毛細(xì)血管擴張充血，腎小囊內(nèi)見少量絲網(wǎng)狀嗜伊紅蛋白沉積。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-3d（LT+CON）:Theglomerulusandrenalinterstitiumcapillariesweredilatedandcongested,andasmallamountofeosinophilicsilkscreendepositionwasseenintherenalMicrocystis.HE,Bar=50μm,200×.圖3-314d不同環(huán)境溫度下灌注BLE小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)Figure3-3theKidneytissuestructureofBLEmiceperfusedunderdifferentenvironmentaltemperaturesat14d圖3-4a（NT+CON）：腎臟組織結(jié)構(gòu)夠完整，未見明顯的病理學(xué)變化。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-4a（NT+CON）:Therenaltissuestructureiscompleteenoughwithoutobviouspathologicalchanges.HE,Bar=50μm,200×.圖3-4b（NT+BLE）：腎小管上皮細(xì)胞腫脹，顆粒變性。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-4b（NT+BLE）:Swellingandgranulardegenerationofrenaltubularepithelialcells.HE,Bar=50μm,200×.圖3-4c（LT+CON）：腎小管上皮細(xì)胞腫脹呈空泡狀。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-4c（LT+CON）:Theepithelialcellsofrenaltubuleswereswollenandvacuolated.HE,Bar=50μm,200×.圖3-4d（LT+BLE）：腎小管上皮細(xì)胞腫脹。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-4d（LT+CON）:Swellingofrenaltubularepithelialcells.HE,Bar=50μm,200×.圖3-428d不同環(huán)境溫度下灌注BLE小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)Figure3-4theKidneytissuestructureofBLEmiceperfusedunderdifferentenvironmentaltemperaturesat28d3.4.3不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率的檢測由表3-1可知，28d時BLE灌胃劑量水平對小鼠腎臟細(xì)胞凋亡率的影響達到極顯著水平（P=0.004）。與CON組相比，BLE灌注組在14d和28d時腎臟細(xì)胞凋亡率上升，且上升幅度為14.94%（圖3-5a）。與CON組相比，BLE灌注組在14d時腎臟凋亡率有所上升，上升幅度為14.31%；在28d時，腎臟細(xì)胞凋亡率極顯著上升（P=0.004），上升幅度為47.38%（圖3-5b）表3-1不同溫度灌胃BLE對小鼠腎臟細(xì)胞凋亡率的影響，%Table3-1Effectofbambooleafextractonapoptosisrateofkidneycellsinmiceatdifferenttemperatures,%項目/Items時間/Time組別/GroupP值/P-valueNT+CONNT+BLELT+CONLT+BLE溫度/Temperature劑量/Dose交互作用/Interaction細(xì)胞凋亡率14d15.13±2.9519.11±5.3418.24±3.1119.31±2.490.6270.4600.668細(xì)胞凋亡率28d17.28±1.9829.59±1.9217.14±1.0721.11±3.420.0730.0040.081圖4-3不同溫度下灌胃BLE對小鼠腎臟細(xì)胞凋亡率的影響a）表示溫度水平對小鼠肝臟細(xì)胞凋亡率的影響，b）表示BLE灌注劑量水平對小鼠肝臟細(xì)胞凋亡率的影響Figure4-3Effectofbambooleavesextractonapoptosisrateofmiceliverunderdiferrencetemperature3.5討論3.4.1不同溫度下灌注BLE對小鼠卵巢病理組織學(xué)的影響卵巢作為雌性動物生殖系統(tǒng)的核心器官，具有分泌和生殖的功能[77]。因此，卵巢結(jié)構(gòu)正常與否可以直接反應(yīng)出雌性動物的生殖系統(tǒng)的情況。病理學(xué)組織觀察結(jié)果可以直觀的反映出卵巢結(jié)構(gòu)是否出現(xiàn)明顯的病變。有研究表明，在低溫環(huán)境下會引起大鼠卵巢出現(xiàn)異常，導(dǎo)致生殖細(xì)胞被破壞，生殖功能受到影響[78,79]。也有研究表明冷應(yīng)激會導(dǎo)致大鼠卵巢出現(xiàn)明顯的病理改變，各級卵母細(xì)胞數(shù)量明顯改變，且顆粒細(xì)胞排列紊亂，層數(shù)減少[80]。本研究通過對蘇木精-伊紅染色法觀察雌性小鼠卵巢組織的病理情況。在不同環(huán)境溫度下，低溫組與常溫組相比小鼠卵巢的各級結(jié)構(gòu)在14d和28d時均未出現(xiàn)明顯的病理損傷情況；在相同環(huán)境溫度下，灌注BLE小鼠卵巢的各級結(jié)構(gòu)在14d和28d時也未出現(xiàn)明顯的病理變化，說明不同環(huán)境溫度下灌注BLE對小鼠的卵巢組織并未產(chǎn)生明顯的影響。生殖系統(tǒng)中卵巢這一核心器官未受到明顯的損傷，說明小鼠的在生殖系統(tǒng)處于相對正常情況，這與前人研究結(jié)果不同，推測可能與試驗動物的品種以及低溫處理的時間長短有關(guān)。3.4.2不同環(huán)境溫度下灌注BLE對小鼠腎臟病理組織學(xué)影響腎臟作為動物泌尿系統(tǒng)的重要器官，其結(jié)構(gòu)的正常與否可以直觀的反應(yīng)泌尿系統(tǒng)的情況。研究表明，寒冷環(huán)境會導(dǎo)致SD大鼠的腎臟結(jié)構(gòu)和功能受損，把正常的大鼠持續(xù)置于低溫環(huán)境下會導(dǎo)致腎小球以及腎小管出現(xiàn)明顯的炎癥現(xiàn)象[81,82]。另有研究表明，反復(fù)低溫暴露會直接導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞空泡的形成、腎小球肥大等明顯的腎損害[83,84]。由此可知，寒冷環(huán)境會導(dǎo)致動物的腎臟結(jié)構(gòu)損傷，進而導(dǎo)致功能受損。本實驗結(jié)果表明，實驗前期，LT組與NT組相比，腎臟組織中出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞腫脹顆粒變性，到了實驗后期，大部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹呈空泡狀。在低溫環(huán)境下，灌注BLE后，腎小管上皮細(xì)胞腫脹程度較輕，且此狀態(tài)細(xì)胞數(shù)目相對較少，由此可見，BLE能夠?qū)Φ蜏丨h(huán)境下引起的腎臟結(jié)構(gòu)改變具有改善作用，能夠?qū)π∈蟮拿谀蛳到y(tǒng)起到一定的保護效果，但并不能完全逆轉(zhuǎn)損傷情況。3.4.3不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率的影響細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為機體在受到外源物質(zhì)影響的時候，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)會隨之改變，為維持穩(wěn)定，宿主細(xì)胞在多基因的控制下程序性死亡。在寒冷環(huán)境下，會直接導(dǎo)致臟器受到損傷。結(jié)果顯示28d時BLE灌胃劑量水平對小鼠腎臟細(xì)胞凋亡率的影響達到極顯著水平（P=0.004）。與CON組相比，BLE灌注組在14d和28d時腎臟細(xì)胞凋亡率上升，且上升幅度為14.94%。與CON組相比，BLE灌注組在14d時腎臟凋亡率有所上升，上升幅度為14.31%；在28d時，腎臟細(xì)胞凋亡率極顯著上升（P=0.004），上升幅度為47.38%。灌注BLE導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡率上升，我們推測在低溫環(huán)境下引起的臟器損傷竹葉提取物中的有效成分未能起到改善作用，這可能與實驗動物的品種以及實驗處理時長有關(guān)系。第4章結(jié)論及有待于進一步研究的問題第4章結(jié)論及有待于進一步研究的問題4.1結(jié)論本研究按照不同溫度環(huán)境下，不同梯度灌胃劑量，通過臟器系數(shù)、血清和組織抗氧化指標(biāo)檢測、血清免疫指標(biāo)和血清雌激素水平這幾個層面篩選出巴山木竹葉提取物對雌性小鼠的最適灌胃劑量。在此基礎(chǔ)長探究不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠泌尿生殖系統(tǒng)的影響，按照2×2因子設(shè)計，即溫度（25℃、4℃）與灌胃劑量（0、340mg/kg）進行二水平因子設(shè)計。運用組織病理學(xué)流式細(xì)胞術(shù)等方法，對不同條件下小鼠卵巢組織病理形態(tài)，腎臟組織病理形態(tài)和腎臟組織細(xì)胞凋亡率等指標(biāo)進行檢測。溫度和灌胃劑量對小鼠臟器系數(shù)無顯著影響，說明對小鼠不會產(chǎn)生明顯的毒理作用。通過對抗氧化指標(biāo)的檢測，顯示出，低溫低劑量條件下，SOD含量最高，MDA含量最低，灌注低劑量的BLE在一定程度上刺激機體的抗氧化反應(yīng)，抵御外界應(yīng)激對機體的不利影響，一定層面上說明了BLE具有抗冷應(yīng)激的作用。血清免疫指標(biāo)結(jié)果顯示，低溫低劑量組含量最低，表明機體免疫應(yīng)答反應(yīng)相對較緩和，在此劑量下，緩解了免疫應(yīng)答。血清中雌激素含量不同處理之間變化幅度大，但都低于低溫對照組，說明低溫能引起機體激素分泌增加；就不同劑量而言，均低于低劑量組，說明在低溫環(huán)境下，灌注低劑量的BLE能刺激機體雌激素處于相對穩(wěn)定水平。因此，得出不同環(huán)境溫度下灌注BLE實驗方法。不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠泌尿生殖系統(tǒng)的影響從兩方面看，低溫環(huán)境和BLE作用下，對小鼠卵巢組織未產(chǎn)生顯著影響，表明對小鼠生殖系統(tǒng)影響不大，推測可能是實驗處理時間或者實驗動物品種的不同導(dǎo)致的；低溫環(huán)境下小鼠腎臟組織出現(xiàn)不同程度的腫脹，甚至呈空泡狀，表明低溫引起腎臟組織損傷，灌注BLE后，腎小管上皮細(xì)胞任然出現(xiàn)腫脹情況，但相較無劑量組而言，細(xì)胞數(shù)目較少，且程度相對較輕，表明BLE能在一定程度上緩解低溫引起的腎臟組織損傷。4.2有待進一步研究的問題本研究建立了不同環(huán)境溫度下灌注BLE實驗方法，初步探究了不同環(huán)境溫度下BLE對小鼠泌尿生殖系統(tǒng)的影響。BLE是一種化合物而非純凈物，成分復(fù)雜，對其中產(chǎn)生主要作用的成分有哪些還有待進一步探究。而發(fā)揮主要作用的成分在進入機體后有時怎樣發(fā)揮作用還是未知。因此，下一步研究計劃為對BLE中主要活性成分進行提純并定量并進行體外細(xì)胞實驗進一步驗證。致謝參考文獻張璐.本經(jīng)逢原(中醫(yī)經(jīng)典文庫)[M].2007.李飛躍,喻國光,陳金珠等.竹葉主要化學(xué)成分分析及其生物活性研究現(xiàn)狀[J].江西林業(yè)科技,2006(4):34-36.張英,丁霄霖.竹葉有效成分和抗活性氧自由基效能的研究[J].竹子學(xué)報,1996(3):17-24.FaisalH.A.Othman.Primarystudiesonlactoneinbambooleaf[D].ThisisforMSdegreeofZhejiangUniversity,2000.唐莉莉,徐榕榕.竹葉多糖對小鼠移植瘤的抑制作用[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報：食品與生物技術(shù),1998(3):62-65.張英,丁霄霖,王樹英.竹葉特種氨基酸的存在及其生物學(xué)意義[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報,1997(1):29-32.張英,湯堅.竹葉精油和頭香的CGC-MS-DS研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1998(4):38-44.劉翠,王文久.竹葉資源研究進展及開發(fā)利用─—兼談云南叢生竹竹葉資源開發(fā)對策[J].林業(yè)建設(shè),1999(06):10-14.袁亞男,陳承瑜,楊濱,etal.31種黃酮、酚酸類化合物和10種中藥清除DPPH能力考察[J].中國中藥雜志,2009(13):80-85.高志強,徐強,宋仲容,etal.黃酮類化合物抗氧化活性構(gòu)效關(guān)系的密度泛函理論研究[J].化學(xué)世界,2008,49(7):439-443.宋仲容,江相蘭,李樹偉,etal.竹葉提取物的抗氧化活性研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2006(1):67-69.馬世玉,李莉,羅德生,etal.竹葉水溶性提取液抗氧化作用的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2005(06):11-12.倪勤學(xué).黃條金剛竹葉有效組分及其輻射防護作用研究[D].浙江大學(xué),2013.王慧.七種竹葉提取物抗氧化活性及提取工藝優(yōu)化研究[D].中國林業(yè)科學(xué)研究院,2012.張蕾,王姝,倪勤學(xué),etal.鵝毛竹葉提取物抗氧化及酪氨酸酶抑制活性的研究[J].浙江林業(yè)科技,2014(5):8-15.何躍君,岳永德,湯鋒.用清除有機自由基DPPH法評價竹葉揮發(fā)油抗氧化能力[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009(03):80-84.劉萍,高云濤,楊露,etal.竹葉蘭不同部位提取物清除DPPH自由基的研究[J].北方園藝,2013(19):80-83.ChoiDB,ChoKA,NaMS,etal.Effectofbamboooilonantioxidativeactivityandnitritescavengingactivity[J].JournalofIndustrial&EngineeringChemistry,2008,14(6):765-770.李水芳,戴瑜,李姣娟.闊葉箬竹葉提取物清除自由基能力及抑菌效果的比較研究[J].食品科技,2010(04):181-184.戴承恩.楊梅黃酮降血糖和竹葉黃酮降血脂的分子作用機制初探[D].浙江工業(yè)大學(xué),2014.付彥君,陳靖.淡竹葉提取物對實驗性高脂血癥大鼠血脂的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,29(6):965-966.王慧霞,王忠義,楊聚才,etal.兩種竹提取物的體外抗菌活性研究[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2010(11).賈桂云,鄒潤英,郭飛燕.竹葉提取物抑菌效果研究[J].海南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2010(04):70-72.吳耀輝,曾超珍,龔燕飛.佛肚竹竹葉提取物的抗菌作用[J].食品科技,2010(10).吳耀輝,曾超珍,龔燕飛.掛綠竹竹葉提取物的抗菌作用[J].食品科技,2008,33(1):194-196.魏琦,姚曦,孫嘏,etal.苦竹葉化學(xué)成分對細(xì)菌及3種腫瘤細(xì)胞的抑制活性[J].林業(yè)科學(xué),2015(05):90-97.SekiT,KidaK,MaedaH.Immunostimulation-MediatedAnti-TumorActivityofBamboo(Sasasenanensis)LeafExtractsObtainedunder‘Vigorous’Condition[J].Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine,2010,7(4):447-457.竹葉提取液對ASP-Ⅰ肺癌細(xì)胞生長的影響[J].咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2002(01):21-22.姚旌旗,馬世玉,李映紅,etal.竹葉提取液抑制小鼠移植性肺癌生長的實驗研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2004(10):15-17.姚旌旗,李映紅,劉紅梅,etal.竹葉提取液對H22肝癌細(xì)胞生長的影響[J].咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2002,16(4).IlhamAM,VimalaS,RashihAA,etal.AntioxidantandantityrosinasepropertiesofMalaysianbambooleafextracts[J].JournalofTropicalForestScience,2008,20(2):123-131.許鋼,張虹,董建紅.竹葉提取物清除O^—2?和?OH的研究[J].浙江林業(yè)科技,2000(03):17-21.張英,唐莉莉.毛金竹葉提取物抗衰老作用的實驗研究[J].竹子研究匯刊,1997(4).潘佳佳,葉生月,丁東棟等.4種竹子竹葉黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化活性的季節(jié)變化[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報,2014,31(2):280-284.Jinyan,Gong,Daozong,etal.Functionalcomponentsofbambooshavingsandbambooleafextractsandtheirantioxidantactivitiesinvitro.[J].JournalofMedicinalFood,2015.陳彥,林曉艷.箭竹葉提取物的抗微生物作用[J].食品科學(xué),2006(05):44-47.陸志科,謝碧霞.不同種竹葉的化學(xué)成分及其提取物抗菌活性的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報,2005,20(1):49-52.張盛.竹葉黃酮的抗炎作用及物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D].湖北中醫(yī)藥大學(xué),2016唐浩國,魏曉霞,李葉等竹葉黃酮對小鼠脾細(xì)胞免疫的分子機制研究[J].食品科學(xué),2007(9).Chrousos,GeorgeP.Stressanddisordersofthestresssystem[J].NatureReviewsEndocrinology,2009,5(7):374-381.Varela,Sara,Lima-Ribeiro,MatheusSouza,Diniz-Filho,JoséAlexandreFelizola,等.DifferentialeffectsoftemperaturechangeandhumanimpactonEuropeanLateQuaternarymammalianextinctions[J].GlobalChangeBiology,2015,21(4):1475-1481.ThomasJR,AhlersST,HouseJF,etal.Repeatedexposuretomoderatecoldimpairsmatching-to-sampleperformance.[J].AviationSpace&EnvironmentalMedicine,1989,60(11):1063.WestfallTC,YangCL,ChenX,etal.Anovelmechanismpreventsthedevelopmentofhypertensionduringchroniccoldstress[J].AutonomicandAutacoidPharmacology,2005,25(4):171-177.FuJ,LiuCP,ZhangZW,etal.Influenceofinflammatorypathwaymarkersonoxidativestressinducedbycoldstressinintestineofquails[J].ResearchinVeterinaryScience,2013,95(2):495-501.KaushikS,KaurJ.Effectofchroniccoldstressonintestinalepithelialcellproliferationandinflammationinrats[J].Stress:TheInternationalJournalontheBiologyofStress,2005,8(3):191-197.LiuY,LiuY,JinH,etal.Coldstress-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