茯磚茶中冠突散囊菌檢測(cè)方法的改進(jìn)

茯磚茶中冠突散囊菌檢測(cè)方法的改進(jìn)

福磚茶是中國(guó)特有的邊茶。它是邊境地區(qū)人民預(yù)防疾病的主要藥物，也是人們生活中維生素和養(yǎng)分的重要來(lái)源，因此它引起了人們的注意[1.2]。成品茯磚茶表面存在一種俗稱“金花”的金黃色小點(diǎn)。研究表明,該“金花”是冠突散囊菌的閉囊殼堆,其多少?zèng)Q定了茯磚茶的品質(zhì),多者為佳,因此冠突散囊菌在茯磚茶中的含量已成為了茯磚茶品質(zhì)評(píng)判的主要指標(biāo)。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T9833.3-2002緊壓茶茯磚茶》規(guī)定每克茯磚茶干茶中冠突散囊菌菌數(shù)不小于3.0×105。茯磚茶中的主要菌群是散囊菌屬和一些霉菌,因此除了冠突散囊菌以外還存在著大量的形態(tài)與之相似的散囊菌,如間型散囊菌、謝瓦散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌、棲土曲霉和蠟葉散囊菌等[4，5],這些菌的存在嚴(yán)重影響了冠突散囊菌的準(zhǔn)確檢測(cè)。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)方法對(duì)茯磚茶中的常見散囊菌和曲霉進(jìn)行對(duì)比研究,使茯磚茶中的冠突散囊菌與一些常見的其他霉菌可進(jìn)行區(qū)分,以期為茯磚茶中冠突散囊菌檢測(cè)方法的改進(jìn)提供依據(jù)。1材料和方法1.1微生物菌種的保鮮冠突散囊菌(Eurotiumcristatum,CGMCC3.0462)、間型散囊菌(Eurotiumintermedium,CGMCC3.4318)、謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri,CGMCC3.6492)、阿姆斯特丹散囊菌Eurotiumams-telodami,CGMCC3.6518)、棲土曲霉(Aspergillusterri-cola,CGMCC3.3557)、蠟葉散囊菌(Eurotiumherbari-oum,CGMCC3.6496),購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院食品所微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。1.2主試劑和設(shè)備1.2.1nano33.0馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,pH自然。察氏培養(yǎng)基(g/L)[6，7]:NaNO33.0,K2HPO41.0,KCl0.5,MgSO4.7H2O0.5,FeSO4.7H2O0.01,蔗糖30,瓊脂20,pH自然。20%蔗糖察氏培養(yǎng)基(g/L):NaNO33.0,K2HPO41.0,KCl0.5,MgSO4.7H2O0.5,FeSO4.7H2O0.01,蔗糖200,瓊脂20,pH自然。1.2.2日本生物安全柜型LRH生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司),BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰公司),YS100型光學(xué)顯微鏡(日本尼康株式會(huì)社)。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1d活化試驗(yàn)取保藏于4℃冰箱中的斜面菌種,用接種環(huán)刮取一環(huán)菌種接種到PDA斜面上,28℃培養(yǎng)7d進(jìn)行活化。用無(wú)菌生理鹽水洗下活化后的斜面,制備成菌懸液(孢子懸液),然后用接種針?lè)謩e蘸取各菌種菌懸液(孢子懸液)點(diǎn)種于PDA平板、察氏平板和20%蔗糖察氏平板上,28℃培養(yǎng)14d。1.3.2關(guān)于群落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)的觀察培養(yǎng)過(guò)程觀察菌落形態(tài)變化,并挑取菌體進(jìn)行制片觀察[7~9]。2養(yǎng)基對(duì)受試菌菌體形態(tài)的影響實(shí)驗(yàn)通過(guò)跟蹤茯磚茶中常見的不同散囊菌和曲霉在PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和20%蔗糖察氏培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況,考察不同培養(yǎng)基對(duì)受試菌的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)的影響。結(jié)果表明,所有受試菌株在各種培養(yǎng)基上前1d~2d菌落、菌絲均為白色,無(wú)特征形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn),3d后菌落菌體開始出現(xiàn)各種形態(tài)變化,5d后各菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)都趨于穩(wěn)定,且不同散囊菌和曲霉在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)會(huì)發(fā)生不同程度的形態(tài)變化。根據(jù)文獻(xiàn)和,選擇培養(yǎng)至第14d的菌落形態(tài)和顯微圖像進(jìn)行分析,結(jié)果見圖1,圖2和圖3。2.1顯微結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)特點(diǎn)冠突散囊菌在PDA上的生長(zhǎng)速度為78mm/14d,菌落成絨狀,圓形,中間菌體較高,正面為草綠色,背面為灰白色,無(wú)脊無(wú)褶;菌絲有足細(xì)胞,分生孢子梗的末端膨大形成球狀的頂囊,分生孢子呈球形,綠色,成串生長(zhǎng)。阿姆斯特丹散囊菌在PDA上的生長(zhǎng)速度為55mm/14d,菌落呈絮狀,菌絲稀疏,邊沿不整齊,菌落為淺綠色,背部形態(tài)與顯微結(jié)構(gòu)均與冠突散囊菌相似。蠟葉散囊菌在PDA上的生長(zhǎng)速度為73mm/14d,菌落為扁平絨狀,邊沿不整齊,菌落為黃色,菌落背面黃色、中心部位顏色較深,光滑無(wú)脊;菌絲有隔,有足細(xì)胞,分生孢子梗的為棒狀,較短,分生孢子呈球形或橢圓形,成串生長(zhǎng),數(shù)量不多。棲土曲霉在PDA上的生長(zhǎng)速度為43mm/14d,菌落形態(tài)顏色和菌體顯微結(jié)構(gòu)與冠突散囊菌均相似,不過(guò)其菌落邊沿易散落生長(zhǎng)小菌落且菌體生長(zhǎng)速度較慢。謝瓦散囊菌在PDA上的生長(zhǎng)速度為86mm/14d,菌落正面為淺綠色絨毛狀,邊沿整齊,背面也為灰白色,無(wú)脊;其顯微結(jié)構(gòu)與冠突散囊菌有較大的差別,球形頂囊較冠突散囊菌小,成串生長(zhǎng)的球形孢子數(shù)量極多,分生孢子頭呈拖把頭狀。間型散囊菌在PDA上的生長(zhǎng)速度為46mm/14d,菌落正面反與冠突散囊菌相似;有倒置燒瓶狀分生孢子頭,孢子呈球形。所有受試菌在PDA上培養(yǎng)均無(wú)閉囊殼產(chǎn)生。2.2生長(zhǎng)和形態(tài)特征由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,冠突散囊菌在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為90mm/14d,菌落為絨狀,平整,菌體密度高于PDA,菌落中間部分為黃色,有大量的金黃色閉囊殼,菌落外圈為綠色,夾帶些許黃色閉囊殼,菌落背面為黃褐色、邊沿有分布有3~5mm長(zhǎng)的放射狀脊,有球型分生孢子頭。阿姆斯特丹散囊菌在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為63mm/14d,菌落形態(tài)與冠突散囊菌幾乎一樣,不過(guò)其中間部位黃色閉囊殼含量較低,菌落背面黃褐色顏色更深,背面分布有大量10~15mm長(zhǎng)放射狀脊。蠟葉散囊菌在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為41mm/14d,菌落密實(shí),絨狀,表面多褶皺呈魚鱗狀,邊沿整齊,菌落正面都為蛋黃色,有大量的黃色閉囊殼,無(wú)分生孢子頭,菌落背面為黃褐色,中心部位顏色較深。棲土曲霉在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為75mm/14d,菌落正反面形態(tài)與阿姆斯特丹散囊菌相似,不同之處在于其中心部位亦有短小的褶,邊沿分布的放射狀脊長(zhǎng)度在5-10mm間,且分布均勻。謝瓦散囊菌在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為80mm/14d,菌落為褐色絨毛狀,邊沿整齊,菌落背面為褐色,菌落顏色較其它受試菌相對(duì)于PDA發(fā)生了非常顯著的變化,同時(shí)其有10-30mm長(zhǎng)的放射狀脊。間型散囊菌與冠突散囊菌的生長(zhǎng)情況基本一樣,不過(guò)其分生孢子頭由原來(lái)在PDA的球形變成拖把頭樣。2.3菌落形態(tài)和形態(tài)冠突在20%蔗糖察氏培養(yǎng)基上,其生長(zhǎng)速度為85mm/14d,菌落毛絨狀,中間高、邊沿低,正面整體呈黃色,中心部位較邊沿更黃,有大量的金黃色閉囊殼分布,菌落背面為黃色,無(wú)脊光滑,有分生孢子頭。阿姆斯特丹散囊菌在20%蔗糖察氏培養(yǎng)基上,其生長(zhǎng)速度為76mm/14d,菌落菌體形態(tài)與冠突散囊菌相近,不同在于其中心部位有5~15mm長(zhǎng)放射狀脊。蠟葉散囊菌在20%蔗糖察氏培養(yǎng)基上,其生長(zhǎng)速度為86mm/14d,菌落絨狀,扁平,菌落正面為黃綠色,中心部位為黃色、邊緣有斑駁的綠色,有少量的黃色閉囊殼分布,有部分分生孢子頭,菌落背面為黃褐色,中心部位和邊沿顏色較深,無(wú)脊。棲土曲霉在20%蔗糖察氏培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度為83mm/14d,菌落菌體形態(tài)與冠突散囊菌相似。差異在于其中心部位有3-10mm長(zhǎng)的曲折狀脊。謝瓦散囊菌在20%蔗糖察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為84mm/14d,菌落為黃綠色絨毛狀,顏色較冠突散囊菌淺,中心部位有白色絲狀菌絲,有分生孢子頭,孢子成串生長(zhǎng),菌落背面為灰白色,無(wú)脊。間型散囊菌在20%蔗糖察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為88mm/14d,菌落形與冠突散囊菌相似,不過(guò)分生孢子串較在察氏培養(yǎng)基上變短。3散囊菌的形態(tài)不同散囊菌和曲霉在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)會(huì)發(fā)生不同程度的形態(tài)變化。在所試的6株菌在PDA培養(yǎng)基上都為無(wú)性生殖,菌落背部皆為光滑無(wú)脊,菌落顏色除了蠟葉散囊菌為黃色外其他菌株都為綠色,而且所有菌種生長(zhǎng)狀況都沒(méi)有察氏培養(yǎng)基和20蔗糖察氏培養(yǎng)基好。在察氏培養(yǎng)基上,不同測(cè)試菌株的菌體形態(tài)相對(duì)于在PDA上生長(zhǎng)時(shí)發(fā)生了明顯的分化,除蠟葉散囊菌有亮黃色變?yōu)榈S色和謝瓦散囊菌由淺綠色變?yōu)楹稚?其他菌落顏色都由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色,不過(guò)顏色變化程度各不相同;菌體普遍有無(wú)性繁殖向有性繁殖轉(zhuǎn)變,特別是蠟葉散囊菌在察氏培養(yǎng)基上均為有性繁殖,未發(fā)現(xiàn)無(wú)性生殖器官;菌落背部顏色和形態(tài)也都發(fā)生了明顯轉(zhuǎn)變,背部顏色都變?yōu)辄S褐色,也都出現(xiàn)了放射狀的褶脊,不過(guò)不同菌株的背部顏色和褶脊的形態(tài)各有差異,這可以應(yīng)用于茯磚茶中散囊菌的鑒別。在20%蔗糖察氏培養(yǎng)基上,冠突散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌和棲土曲霉菌落顏色均由察氏培養(yǎng)基上的黃綠色向金黃色轉(zhuǎn)變,黃色閉囊殼的量也都變多,同時(shí)菌落背面的顏色和形態(tài)也都發(fā)生了不盡相同的變化,如冠突散囊菌和棲土曲霉菌落背面顏色由黃褐色變?yōu)辄S色、有脊變?yōu)闊o(wú)脊,阿姆斯特丹散囊菌背面顏色由黃褐色變?yōu)辄S色、原本分布在菌落邊沿的放射狀脊變成出現(xiàn)在菌落中心位置;蠟葉散囊菌菌落顏色由蛋黃色變成黃綠色,菌落表面由褶皺變成平整,出現(xiàn)分生孢子頭,菌落背面由有褶變