菜蛾盤絨繭蜂卵表面超微結(jié)構(gòu)觀察

菜蛾盤絨繭蜂卵表面超微結(jié)構(gòu)觀察

寄生蟲在主體內(nèi)的成功發(fā)育主要是因?yàn)榧纳x受到保護(hù)，而忽視了主體內(nèi)的紅細(xì)胞囊（vinson，1990）。寄生蜂與寄主昆蟲之間的免疫反應(yīng)和免疫抑制是一個(gè)復(fù)雜的防御與反防御的斗爭(zhēng)過程。迄今為止,在多個(gè)寄生蜂-寄主昆蟲體系中,對(duì)寄生蜂如何克服寄主免疫系統(tǒng)的攻擊進(jìn)行了研究。但是,只有為數(shù)極少的體系中,寄生蜂所擁有的免疫抑制因子被系統(tǒng)的研究過。如中紅側(cè)溝繭蜂-黏蟲MicroplitismediaterHaliday-PseudaletiaseparataWalker體系中揭示了類病毒樣纖絲(virus-likefilaments,VLFs)、多分DNA病毒(polydnavirus,PDV)、毒液和畸形細(xì)胞等的特性及其在免疫抑制方面發(fā)揮的作用(Tanaka,1987;StrandandDover,1991;StrandandWong,1991;秦啟聯(lián)等,2001)。黑頭折脈繭蜂-煙芽夜蛾Cardichilesnigriceps-Heliothisvirescens體系中,蜂卵表面的纖維層使其被動(dòng)逃避寄主血細(xì)胞的包囊,而PDV基因表達(dá)則有破壞寄主煙芽夜蛾血細(xì)胞的功能(DaviesandVinson,1986;Varricchioetal.,1999)。索諾齒唇姬蜂-煙芽夜蛾Campoletissonorensis-H.virescens體系中,姬蜂在寄生初期通過蜂卵表面攜帶的卵巢蛋白發(fā)揮快速、短暫的免疫抑制作用,直至24h后PDV基因表達(dá)產(chǎn)物破壞寄主血細(xì)胞形態(tài),以此建立長(zhǎng)久的免疫抑制機(jī)制(WebbandLuckhart,1996)。除上述提及的體系外,尚缺乏對(duì)寄生體系可能涉及的免疫抑制因子進(jìn)行全面而系統(tǒng)的揭示。而且,從以上研究結(jié)果也不難發(fā)現(xiàn),不同寄生體系中涉及的免疫抑制因子的種類和功能存在著一定的差異。我們認(rèn)為對(duì)于一個(gè)寄生體系,只有在全面探明寄生蜂可能擁有的免疫抑制因子的種類和特性的基礎(chǔ)上,才可能正確評(píng)價(jià)各因子在寄生蜂發(fā)育的不同時(shí)期所發(fā)揮的作用,從而避免片面夸大或忽視某個(gè)因子的作用。而且,有些寄生因子還與寄生蜂的寄生能力有關(guān)(Barrattetal.,2006),直接影響寄生蜂的生物防治效果。鑒于此,在研究菜蛾盤絨繭蜂Cotesiavestalis(Haliday)的幼期發(fā)育和菜蛾盤絨繭蜂多分DNA病毒(Cotesiavestalisbracovirus,CvBV)及其部分基因、畸形細(xì)胞、毒液和卵巢蛋白等特性的基礎(chǔ)上(白素芬等,2002,2003;Chenetal.,2007,2008;Huangetal.,2007,2008;Yuetal.,2007,2008;劉鵬程等,2008;Shietal.,2008a,2008b,2008c),本文以菜蛾盤絨繭蜂-小菜蛾C.vestalis(Haliday)-P.xylostella(L.)為寄生體系,重點(diǎn)對(duì)產(chǎn)卵寄生時(shí)蜂卵攜帶的寄生因子特性進(jìn)行觀察,分析CvBV抑制寄主免疫反應(yīng)的能力,并對(duì)所涉及的寄生因子的免疫抑制能力進(jìn)行討論。寄生蜂免疫抑制因子的系統(tǒng)揭示,將有助于全面理解寄生蜂成功戰(zhàn)勝寄主免疫攻擊的能力,深刻認(rèn)識(shí)寄生蜂與寄主昆蟲的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系,并對(duì)寄生蜂的合理利用發(fā)揮指導(dǎo)作用。1材料和方法1.1不同光照、光照對(duì)小菜螟幼蟲續(xù)代飼養(yǎng)的影響菜蛾盤絨繭蜂在(25±1)℃,RH60%～80%,光照周期14L∶10D,光照強(qiáng)度1000～1500lx的人工氣候室內(nèi)用2～3齡小菜蛾幼蟲續(xù)代飼養(yǎng)。羽化后的成蜂用10%的蜂蜜在保蜂盒內(nèi)飼養(yǎng)。1.2小菜紅樹蟲的放養(yǎng)將交配過的菜蛾盤絨繭蜂雌蜂1頭移入指形管(8cm×1.5cm)中,接入3齡小菜蛾幼蟲1頭,一次寄生行為發(fā)生后,換以未接觸過蜂的同齡小菜蛾幼蟲,控制每蜂寄生5～8頭。將寄生后的小菜蛾幼蟲接入插有嫩甘藍(lán)葉片的小養(yǎng)蟲籠內(nèi)在上述條件的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。每籠接蟲30～40頭,重復(fù)3次。1.36吸引小菜紅蜂的出現(xiàn)按照白素芬等(2003)的方法,用劑量100Gy的60Co照射交配過的雌蜂。隨后按上述方法讓其寄生3齡小菜蛾幼蟲,以此獲得被假寄生小菜蛾,共計(jì)500頭。與未經(jīng)輻射處理的正常雌蜂寄生的同齡小菜蛾幼蟲發(fā)育做比較,同時(shí)均以未被寄生的小菜蛾幼蟲發(fā)育做對(duì)照。正常寄生和未被寄生小菜蛾各60頭。1.4離子束誘變卵的獲得在Ringer’s生理鹽水中將雌蜂整個(gè)生殖系統(tǒng)取出,分別將卵巢管和輸卵管萼區(qū)的卵或單個(gè)卵巢分離;解剖被正常寄生的小菜蛾幼蟲,從中獲得產(chǎn)后2,33和35h蜂卵。固定后制備樣品,除對(duì)2h蜂卵按掃描電鏡樣品方法制備外,其余均以透射電鏡樣品制備,用作電鏡觀察。1.5電子顯微鏡觀察1.5.1掃描電鏡觀察將收集的蜂卵以2.5%戊二醛固定,于4℃冰箱中過夜。經(jīng)0.1mol/LPBS沖洗后,以4%鋨酸后固定,接下來用系列乙醇梯度脫水,臨界點(diǎn)干燥、噴金,掃描電鏡觀察(PhilipsXL30ESEM)。1.5.2透射電鏡觀察將來源于卵巢不同部位的蜂卵、被寄生后0.5和2h小菜蛾幼蟲和解剖獲得的2,33和35h蜂卵分別用2.5%戊二醛前固定4h,0.1mol/L的PBS沖洗,4%鋨酸后固定2h,乙醇梯度脫水,Epon812包埋,超薄切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,透射電鏡觀察(JEM-1200EX)。1.6蜂卵數(shù)量的觀察假寄生后,36h內(nèi)每隔2h定時(shí)解剖小菜蛾10頭。隨后,每日定時(shí)解剖20頭小菜蛾中蜂卵,連續(xù)8d。在相差顯微鏡(LEICADMLMPS30)下,觀察蜂卵的包囊或血細(xì)胞黏附以及黑化情況并進(jìn)行拍照,統(tǒng)計(jì)各類蜂卵數(shù)量。在隨后的寄生時(shí)間內(nèi)繼續(xù)觀察蜂卵是否被包囊直至假寄生后第17d(此時(shí)多數(shù)被假寄生小菜蛾幼蟲開始死亡)。2結(jié)果與分析2.1盤絨卵蜂卵的分離和發(fā)育從卵巢管、輸卵管萼和被正常寄生小菜蛾體內(nèi)分別獲得3種不同發(fā)育狀態(tài)的蜂卵。卵巢管中的卵尚未發(fā)育成熟,卵表面有濾泡細(xì)胞覆蓋,可以看到細(xì)胞下面的纖維層分布在卵殼表面,其厚度約為133nm(圖1:a)。從輸卵管萼中獲得的蜂卵,其卵表面有規(guī)則、整齊的纖維層覆蓋(圖1:b)。寄生后2h,產(chǎn)在寄主小菜蛾體內(nèi)的菜蛾盤絨繭蜂卵表面纖維層依然清晰可見,其厚度約120nm(圖1:c)。隨蜂卵的進(jìn)一步發(fā)育,卵殼下的漿膜已分化為細(xì)胞,即將在蜂卵孵化時(shí)形成游離的畸形細(xì)胞。此時(shí)蜂卵已發(fā)育33h,其卵殼表面的乳頭狀突起非常明顯,長(zhǎng)度可達(dá)1.167μm。此外,在突起的末端有細(xì)絲狀物伸出(圖1:d)。當(dāng)產(chǎn)卵35h時(shí),蜂卵表面已沒有任何物質(zhì)覆蓋,卵殼內(nèi)是發(fā)育著的胚胎,胚胎外是包裹的漿膜細(xì)胞(圖1:e)。通常,蜂卵經(jīng)過36～40h的胚胎發(fā)育后,菜蛾盤絨繭蜂幼蟲孵化,同時(shí)釋放畸形細(xì)胞到寄主小菜蛾的血腔中。2.2蜂卵表面vlfs的存來自卵巢管的蜂卵,其表面沒有觀察到VLFs,只有纖維層或卵殼突起(圖1:a)。而透射電鏡結(jié)果顯示,在輸卵管萼區(qū)的蜂卵與CvBV之間有大量VLFs存在,從卵殼表面到最外層厚度約為800nm(圖2:a)。對(duì)來自輸卵管萼區(qū)的蜂卵進(jìn)行透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),自蜂卵殼表面到最外層的厚度平均達(dá)350nm,再次說明除卵殼的纖維層外還有VLFs的存在(圖2:b)。進(jìn)一步從輸卵管萼區(qū)來源的蜂卵表面可以看到堆積在一起的長(zhǎng)的VLFs(圖2:c)。掃描電鏡結(jié)果也顯示,蜂卵表面密被有濃密的纖絲狀物(圖2:d)。2.3種寄生蟲因子的相互關(guān)系在菜蛾盤絨繭蜂的卵巢萼區(qū),有大量的CvBV粒子充滿在成熟卵周圍。圖2(a)顯示蜂卵卵殼表面的纖維突起、覆蓋著的VLFs以及最外圍異常豐富的CvBV粒子。寄生后0.5h,產(chǎn)在寄主小菜蛾體內(nèi)的蜂卵表面依然可以清晰地觀察到上述3種寄生因子(圖3:a)。產(chǎn)卵后2h,只能明顯地觀察到纖維層和少量的CvBV粒子(圖3:b)。說明CvBV粒子只是在產(chǎn)卵過程中隨蜂卵注入寄主體內(nèi),作短暫的停留后即擴(kuò)散并開始侵染寄主組織細(xì)胞的活動(dòng)。2.4假寄生蟲期蜂卵表面形態(tài)變化若正常產(chǎn)卵寄生,菜蛾盤絨繭蜂卵通常在36h左右孵化。因此,在假寄生后的36h內(nèi)每隔2h定時(shí)解剖,從未發(fā)現(xiàn)蜂卵被包囊,也無寄主血細(xì)胞的黏附。正常寄生3齡小菜蛾后的菜蛾盤絨繭蜂卵均能成功孵化,發(fā)育正常。這說明在菜蛾盤絨繭蜂胚胎發(fā)育時(shí)期,完全可以克服寄主免疫系統(tǒng)的攻擊。在假寄生后3d內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有蜂卵被血細(xì)胞包囊或發(fā)生黑化現(xiàn)象。絕大多數(shù)蜂卵表面光滑(圖4:a)。但在假寄生6d后,60%以上的蜂卵被血細(xì)胞黏附或發(fā)生局部黑化,只有少數(shù)蜂卵保持正常,但從未出現(xiàn)包囊現(xiàn)象(圖4:b)。假寄生后,連續(xù)8d解剖觀察蜂卵的包囊及黑化情況,沒有發(fā)現(xiàn)蜂卵被包囊,說明CvBV基本可以抑制寄主的免疫反應(yīng),保護(hù)寄生蜂在一個(gè)免疫系統(tǒng)被抑制的寄主環(huán)境中正常完成卵期和幼蟲期的發(fā)育。假寄生后7～17d的蜂卵表面出現(xiàn)血細(xì)胞黏附和黑化比例增多現(xiàn)象(圖4:c～i),這表明寄主血細(xì)胞和體液的免疫能力有所恢復(fù)。圖5結(jié)果顯示,從假寄生后第4d起,蜂卵表面血細(xì)胞黏附的比例開始增加,蜂卵表面發(fā)生局部黑化;并隨假寄生時(shí)間的延長(zhǎng),蜂卵表面血細(xì)胞黏附以及黑化的程度加劇(圖5)。以上結(jié)果表明,被假寄生后的小菜蛾幼蟲,在缺乏菜蛾盤絨繭蜂幼蟲和漿膜來源的畸形細(xì)胞情形下,在只有CvBV和毒液等主要寄生因子的作用下,其免疫反應(yīng)能力在假寄生初期被完全抑制,但在后期有一定程度的恢復(fù)。然而,在長(zhǎng)達(dá)17d的觀察時(shí)間內(nèi),蜂卵從未發(fā)生被包囊的事實(shí)則證明了CvBV和毒液的免疫抑制能力很強(qiáng)并且較持久。從假寄生17d的蜂卵周圍成團(tuán)的血細(xì)胞也說明,小菜蛾幼蟲的血細(xì)胞免疫能力受到抑制。3討論3.1寄生蜂卵表面的纖維層和hf-pbs通過dv重組蛋白檢測(cè)cdv蛋白表達(dá)寄主昆蟲的免疫系統(tǒng)能有效識(shí)別和排除異物的入侵,相應(yīng)的寄生蜂也進(jìn)化產(chǎn)生了多種策略加以克服。寄生蜂產(chǎn)卵時(shí)將毒液和卵巢萼腺的分泌物也一同注入寄主體內(nèi)(StrandandPech,1995;Beckage,1997)。卵巢萼液中最關(guān)鍵、最主要的成分是PDV,這通過假寄生及隨后注射PDV抗體得到了證實(shí)(SollerandLanzrein,1996)。PDV在抑制寄主血細(xì)胞包囊的同時(shí),還有抑制血淋巴黑化的能力。然而,PDV基因編碼的免疫抑制蛋白在寄生后不能立即表達(dá),如在注入PDV后3h內(nèi),寄主血細(xì)胞形態(tài)并沒有改變,這說明PDV在寄生初期不可能保護(hù)蜂卵免受寄主血細(xì)胞的包囊(Edsonetal.,1981)。而此時(shí),寄生蜂卵表面的成分似乎首先起到保護(hù)蜂卵的作用(DaviesandVinson,1986;Kinuthiaetal.,1999)。微紅盤絨繭蜂C.rubecula卵表面一種32kDa的蛋白,被證實(shí)在PDV基因編碼的免疫抑制蛋白表達(dá)之前起保護(hù)蜂卵的作用(Asgarietal.,1997,1998)。經(jīng)崩潰酶(driselase)處理的成熟的黑頭折脈繭蜂C.nigrceps蜂卵因表面纖維層的去除而被包囊,而那些表面具有纖維層的蜂卵,卻可以逃避寄主的免疫識(shí)別而不被包囊(DaviesandVinson,1986)。同樣,對(duì)于一種多胚發(fā)育的寄生蜂,注射非成熟卵和經(jīng)酶處理的成熟蜂卵于寄主體內(nèi)后,2h即被包囊;與之相反,成熟卵則不被包囊,它們的區(qū)別就在于纖維層的有無。因此,成熟卵表面的纖維層可能在保護(hù)蜂卵免受寄主免疫攻擊中發(fā)揮重要作用(Huetal.,2003)。有些寄生蜂卵巢萼液中有類病毒樣顆粒(viruslikeparticles,VLPs)或VLFs,它們?cè)诼演嗉?xì)胞中復(fù)制。VLPs或VLFs貼附在蜂卵的表面,為蜂卵營(yíng)造了一個(gè)類似寄主物質(zhì)的外殼,使蜂卵在PDV基因表達(dá)并起作用前,被動(dòng)保護(hù)蜂卵不被寄主免疫系統(tǒng)識(shí)別,從而不受寄主血細(xì)胞的攻擊。如Tanaka(1987)報(bào)道了中紅測(cè)溝繭蜂輸卵管萼液中含有具有DNA分子的VLFs。這種VLFs黏附在蜂卵的表面,對(duì)蜂卵起保護(hù)作用。3.2蜂卵表面突起物vlfs的作用上述的免疫抑制因子信息均來自不同的寄生體系。但對(duì)于同一個(gè)寄生體系,又有哪些免疫抑制因子?各因子作用的時(shí)效性又如何?通過電鏡觀察,在菜蛾盤絨繭蜂-小菜蛾寄生體系中,我們發(fā)現(xiàn)蜂卵表面可分為卵殼表面纖維層以及外層的VLFs,這從掃描電鏡以及比較來源于不同卵巢部位的蜂卵表面結(jié)構(gòu)得到了證實(shí)。VLFs為卵萼中蜂卵所特有,但隨蜂卵注入寄主體后,短暫地與PDV存在于蜂卵表面,隨后擴(kuò)散到寄主的血腔中。而蜂卵卵殼的突起物在寄生33h后依然存在,同時(shí)可以看到從突起物的末端伸出絲狀物,這與Norton和Vinson(1977)的觀察結(jié)果相一致:他們發(fā)現(xiàn),絲狀物從卵殼的幾個(gè)突起物伸出并進(jìn)入寄主血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,表明在無其他免疫因子存在的情況下,卵表面突起物對(duì)蜂卵起到最初的保護(hù)作用。無論是蜂卵表面的纖維層還是VLFs,隨蜂卵注入到寄主體后,在寄生的初期,面對(duì)寄主的免疫攻擊,以被動(dòng)防御的方式首先對(duì)蜂卵起到保護(hù)作用。隨后,包裹在蜂卵表面的絮狀VLFs也如同PDV粒子一樣釋放到寄主的血淋巴中。隨著內(nèi)寄生蜂胚胎的發(fā)育,纖維層不再形成保護(hù)層,此時(shí),PDV的免疫抑制基因開始在小菜蛾血細(xì)胞等部位表達(dá)(Chenetal.,2007,2008),主動(dòng)攻擊寄主的免疫系統(tǒng)。3.3寄生蜂對(duì)小菜紅巖總體的免疫抑制作用PDV對(duì)寄主的免疫抑制可能是瞬時(shí)的,也可能是長(zhǎng)久的(Beckage,1998),不同的寄生體系存在著差異。特別是繭蜂屬PDV的作用就更為復(fù)雜,有的種類是瞬時(shí)的,有的種類則具長(zhǎng)久的抑制作用。為避免發(fā)育胚胎在發(fā)育過程中可能向寄主血淋巴中釋放免疫抑制劑如畸形細(xì)胞或其他物質(zhì),我們通過γ-射線輻射處理菜蛾盤絨繭蜂雌成蜂,使其產(chǎn)在寄主小菜蛾體內(nèi)的卵成為不育卵即造成假寄生。在這樣的條件下,可以排除發(fā)育胚胎、漿膜釋放的畸形細(xì)胞和蜂幼蟲的干擾,完全模擬正常寄生狀態(tài)下,生理劑量的蜂卵