半閉彎尾姬蜂對(duì)小菜蛾幼蟲血細(xì)胞噬菌能力的影響

半閉彎尾姬蜂對(duì)小菜蛾幼蟲血細(xì)胞噬菌能力的影響

吞咽活動(dòng)是由信號(hào)觸發(fā)的一系列緊密的細(xì)胞活動(dòng)。這是細(xì)胞最重要的功能之一（strand，2008）。單細(xì)胞生物通過吞噬攝取外界的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而多細(xì)胞生物則通過吞噬作用參與胚胎發(fā)育過程和體內(nèi)針對(duì)病原物的免疫過程(LavineandStrand,2002)。對(duì)昆蟲而言,血細(xì)胞的吞噬作用更是免疫系統(tǒng)的重要組成部分(Hoffmann,1995;Strand,2008)。在吞噬過程中,首先是功能細(xì)胞表面受體識(shí)別外源異物并將此信號(hào)向胞內(nèi)傳遞,引起胞膜的活化,使細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu),細(xì)胞以偽足伸出的形式進(jìn)行延展從而執(zhí)行吞噬(deWinteretal.,2007)。在寄主-寄生蜂系統(tǒng)中,寄主血細(xì)胞吞噬功能的變化被認(rèn)為是寄生蜂調(diào)控寄主免疫生理的主要手段之一(LiandWebb,1994;Strandetal.,2006)。毒液是寄生蜂影響及調(diào)控寄主生理的基本因子之一,能夠與其他寄生因子,如多分DNA病毒(polydnavirus,PDV)等一起在寄生時(shí)進(jìn)入寄主體內(nèi)。毒液能夠單獨(dú)或在其他寄生因子的協(xié)助下麻痹寄主、影響寄主生長(zhǎng)發(fā)育或者破壞寄主免疫系統(tǒng)(BeckageandGelman,2004)。不同寄生蜂體內(nèi)毒液的成分及功能不同,這與寄生蜂本身所處的系統(tǒng)地位、寄生習(xí)性和寄主范圍等相關(guān)(MoreauandGuillot,2005)。迄今為止,有關(guān)于寄生蜂毒液的研究大多集中于外寄生蜂,其功能主要是導(dǎo)致寄主麻痹或死亡,從而方便幼蜂攝取寄主營(yíng)養(yǎng)以完成個(gè)體發(fā)育(Weaveretal.,2001)。有關(guān)于內(nèi)寄生蜂毒液的研究,特別是毒液作為獨(dú)立因子調(diào)控寄主生理的研究相對(duì)較少且零散(Asgari,2006)。目前,大部分研究認(rèn)為具有PDV的內(nèi)寄生蜂在調(diào)控寄主免疫反應(yīng)的過程中,起主要作用的是PDV而不是毒液(Beckage,1998;Asgari,2006)。內(nèi)寄生蜂毒液的功能主要是協(xié)助PDV或其他寄生因子對(duì)寄主的生理進(jìn)行調(diào)控(MoreauandGulliot,2005),如毀側(cè)溝繭蜂Microplitisdemolitor的毒液?jiǎn)为?dú)不能對(duì)其寄主造成任何影響,但是卻能對(duì)PDV起到增效作用(StrandandDover,1991)。然而,也有研究表明,內(nèi)寄生蜂的毒液具有一定的單獨(dú)行使功能的能力,如高濃度的菜蛾盤絨繭蜂Cotesiavestalis毒液能夠在短時(shí)間內(nèi)抑制寄主小菜蛾幼蟲血細(xì)胞的延展能力(Yuetal.,2007)。事實(shí)上,內(nèi)寄生蜂毒液在內(nèi)寄生蜂調(diào)控寄主的過程中發(fā)揮了眾多作用(表1)(Asgari,2006)。半閉彎尾姬蜂DiadegmasemiclausumHellen是小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaL.的優(yōu)勢(shì)內(nèi)寄生蜂(Waterhouse,1992),擁有PDV和毒液等寄生因子(Huangetal.,2008b),能夠?qū)闹餍〔硕甑臓I(yíng)養(yǎng)生理和免疫系統(tǒng)進(jìn)行有效的調(diào)控(Huangetal.,2008a,2009)。但是關(guān)于半閉彎尾姬蜂毒液的功能卻鮮有報(bào)道。目前已有研究表明,半閉彎尾姬蜂寄生能夠減少被寄生小菜蛾幼蟲體內(nèi)的血細(xì)胞數(shù)量,細(xì)胞的延展和包囊作用也暫時(shí)受到抑制,但經(jīng)過一段時(shí)間后可恢復(fù)(Huangetal.,2009)。但并無(wú)研究?jī)?nèi)容涉及血細(xì)胞吞噬功能的變化,也不涉及單獨(dú)寄生因子對(duì)此過程的調(diào)控研究。本文在此基礎(chǔ)上,就半閉彎尾姬蜂毒液對(duì)寄主血細(xì)胞的延展行為及吞噬作用的影響展開研究,期望可以進(jìn)一步明確半閉彎尾姬蜂調(diào)控寄主小菜蛾血細(xì)胞免疫的生理機(jī)制。1材料和方法1.1幼蟲放養(yǎng)及寄生蟲小菜蛾在控光(14L∶10D,光照強(qiáng)度>1000lx)、控溫(22±1℃)、控濕(相對(duì)濕度60%～80%)的養(yǎng)蟲室或智能人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)。按李廣宏等(1995)的方法,以20%的蜂蜜水飼養(yǎng)成蛾,盆栽甘藍(lán)飼養(yǎng)幼蟲。半閉彎尾姬蜂采自鄭州郊區(qū),在控光、溫、濕的人工氣候室內(nèi),參照陳宗麒等(2003)方法進(jìn)行繁殖及續(xù)代,成蜂供給10%的蜂蜜水。小菜蛾2齡幼蟲大小及生理狀態(tài)具有高度的一致性,因此為保證實(shí)驗(yàn)中處理與對(duì)照的可比性,試蟲均采用剛進(jìn)入3齡的幼蟲,即先挑取2齡末幼蟲,待其蛻皮后用于寄生。采用“單頭單管寄生”的方法寄生供試的小菜蛾幼蟲,具體操作如下:在一支長(zhǎng)8cm、直徑1.5cm的小試管內(nèi)引入羽化2d已交配過的雌蜂1頭,然后用毛筆挑取小菜蛾幼蟲1頭放入管內(nèi),觀察產(chǎn)卵行為發(fā)生一次后用毛筆移出幼蟲,換另1頭未寄生的幼蟲重復(fù)操作。將寄生過的小菜蛾幼蟲接到事先準(zhǔn)備好的葉片或盆菜上飼養(yǎng),用于實(shí)驗(yàn)。1.2幼蟲的消毒處理小菜蛾幼蟲在-20℃冷凍麻痹,依次用75%的酒精和PBS(pH7.4)清洗體表并在濾紙上擦干后,在Parafilm膜上用滅菌后眼科剪剪去幼蟲的腹足,待血淋巴自然流出后用無(wú)菌毛細(xì)管吸取并加入到預(yù)先添加昆蟲血細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中,在25℃下孵育。1.3蛋白毒囊檢測(cè)收集半閉彎尾姬蜂雌蜂,活體條件下封凍于-80℃,2周內(nèi)集齊100頭雌蜂然后進(jìn)行解剖收取毒液。解剖時(shí),解凍雌蜂并依次用75%的酒精、PBS(pH7.4)清洗體表并在濾紙上吸干后,冰上解剖雌蜂,收集毒腺,撕破毒囊,使毒液釋放到20μLPBS中,-80℃貯藏或直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Bradford方法測(cè)蛋白毒囊內(nèi)蛋白含量。SDS分析蛋白組分,電泳條件為:12%的分離膠,2.5%濃縮膠,電極緩沖液為Tris-甘氨酸電極緩沖液系統(tǒng);電泳電壓80V。1.4在原代培養(yǎng)的未寄生小菜蛾幼蟲血細(xì)胞培養(yǎng)液中加入毒液,使培養(yǎng)液中的毒液濃度分別達(dá)到0.01,0.02,0.04,0.06,0.08和0.1當(dāng)量/μL;每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù),分別于1h和4h后置于Leica倒置顯微鏡(LeicaDMIRB)下觀察漿血細(xì)胞和顆粒血細(xì)胞的延展行為,漿血細(xì)胞變?yōu)樗笮位蚱渌灰?guī)則形狀則判為延展,顆粒血細(xì)胞以伸出偽足為延展,兩種細(xì)胞均以圓形為未延展。1.5外周血輸注后小鼠紅細(xì)胞噬菌能力檢測(cè)大腸桿菌Escherichiacoli的異硫氰酸熒光素(fluorescein-5-isothiocyanate,FITC)標(biāo)記方法參考Beck和Strand(2005)。將熱滅活的大腸桿菌放入0.5%含F(xiàn)ITC(0.1mg/mL)的碳酸緩沖液(pH9.5),使其終濃度達(dá)到109/mL,置于37℃培養(yǎng)30min后,用磷酸緩沖液清洗菌體直至上清不含F(xiàn)ITC為止,于-20℃貯存。噬菌作用具體試驗(yàn)步驟如下:100μL細(xì)胞培養(yǎng)基中加入苯基硫脲(phenylthiourea,PTU)(0.02%),加入1頭小菜蛾的血淋巴,25℃培養(yǎng)30min后,加入FITC標(biāo)記的大腸桿菌,大腸桿菌與血細(xì)胞的數(shù)量比在15∶1～30∶1之間;25℃中放置2～3h后在熒光倒置顯微鏡(LeicaDMIRB)下觀察血細(xì)胞的噬菌狀況。試驗(yàn)分2組處理:處理Ⅰ為半閉彎尾姬蜂寄生(即包含毒液和PDVs等的所有寄生因子)對(duì)小菜蛾幼蟲血細(xì)胞噬菌能力的影響,樣品取自寄生后1h和24h的小菜蛾幼蟲,分別設(shè)5個(gè)重復(fù);處理Ⅱ?yàn)槎疽簩?duì)血細(xì)胞噬菌能力的影響,樣品為未被寄生的小菜蛾幼蟲血淋巴,并在培養(yǎng)液中加入梯度濃度的毒液,分別為0.01,0.02,0.04,0.06,0.08和0.1當(dāng)量/μL,每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)。2結(jié)果2.1半閉彎尾姬蜂濾液的電泳分析單頭半閉彎尾姬蜂毒液囊中蛋白含量為0.106±0.016μg。通過SDS電泳分析,半閉彎尾姬蜂毒液中大部分蛋白的分子量集中在35～220kDa之間,其中分子量在35～70kDa之間的幾種小分子蛋白的含量相對(duì)較高;同時(shí),在電泳圖中也出現(xiàn)了少數(shù)分子量小于15kDa的小肽(圖1)。2.2小菜器紅細(xì)胞在培養(yǎng)液中的殘留情況測(cè)定,對(duì)于小菜紅為了明確毒液的功能,本試驗(yàn)將正常小菜蛾血細(xì)胞提取后進(jìn)行體外培養(yǎng),同時(shí)在培養(yǎng)液中加入不同濃度的毒液。結(jié)果表明,小菜蛾血細(xì)胞能夠在含有0.01～0.1當(dāng)量/μL毒液的培養(yǎng)液中正常延展;且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),血細(xì)胞的延展能力不受到影響(圖2)。2.3小菜紅酵母的培養(yǎng)在含有不同濃度(0.04,0.06,0.08和0.1當(dāng)量/μL)半閉彎尾姬蜂毒液的培養(yǎng)液中進(jìn)行小菜蛾幼蟲血細(xì)胞的培養(yǎng),同時(shí)也加入足量的經(jīng)FITC標(biāo)記的大腸桿菌。結(jié)果顯示,即使培養(yǎng)液中含有較高濃度的半閉彎尾姬蜂毒液,但小菜蛾顆粒血細(xì)胞仍然能夠順利地吞噬大量的大腸桿菌(圖3)。2.4小菜器紅細(xì)胞的動(dòng)態(tài)半閉彎尾姬蜂寄生時(shí)會(huì)將毒液、PDV及萼液蛋白等寄生因子同時(shí)注入小菜蛾幼蟲血腔內(nèi)。將寄生后1h的寄主幼蟲血細(xì)胞取出后進(jìn)行體外培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有的顆粒血細(xì)胞和漿血細(xì)胞都不能延展,無(wú)法如對(duì)照細(xì)胞一般伸出明顯的偽足,而呈現(xiàn)圓餅狀(圖4:A)。雖然圖4(A)中的顆粒血細(xì)胞無(wú)法發(fā)生延展,但是,其細(xì)胞膜周圍卻附著著大量的大腸桿菌,然而附著在胞膜表面的大腸桿菌并沒有被進(jìn)一步吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(圖4:B)。半閉彎尾姬蜂寄生后24h的小菜蛾幼蟲血細(xì)胞能夠正常延展,如圖4(C)所示。從圖中可以看到,漿血細(xì)胞伸出明顯長(zhǎng)且不規(guī)則的偽足,而顆粒血細(xì)胞的偽足則相對(duì)較短且密;同時(shí),在發(fā)生延展的顆粒血細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可以明顯地觀察到發(fā)出熒光的亮點(diǎn),即經(jīng)過FITC標(biāo)記的大腸桿菌(圖4:D)。3半閉彎尾姬蜂注射液主要功能蛋白分布毒液是寄生蜂與寄主協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果,在調(diào)節(jié)寄主發(fā)育、保證寄生蜂成功寄生中發(fā)揮著非常重要的作用(Quicke,1997)。研究發(fā)現(xiàn),大部分寄生蜂毒液蛋白分子量都比較大(MoreauandGuillot,2005),如近曲斑甲腹繭蜂Chelonussp.nearcurvimaculatus(LelukandJones,1989)、麥蛾繭蜂Braconhebetor(Quistadetal.,1994)和菜粉蝶絨繭蜂Cotesiaglomeratus(Leluketal.,1989)毒液中的蛋白分子量分別不低于30,20和18kDa。但是也有一些寄生蜂的毒液中存在小分子多肽,如東方旋小蜂Eupelmusorientalis(Douryetal.,1997)、瘤姬蜂Pimplahypochondriaca(Danietal.,2003)、縮基反顎繭蜂Asobaratabida(Moreauetal.,2004)、微紅絨繭蜂Cotesiarubecula(Zhangetal.,2004a)和頸雙緣姬蜂Diadromuscollaris(酈衛(wèi)弟等,2006)等毒液中發(fā)現(xiàn)了分子量小于10～15kDa的多肽。半閉彎尾姬蜂毒液蛋白的分子大小具備寄生蜂毒液的特點(diǎn),既有大于100kDa的大分子蛋白,也含有個(gè)別小于15kDa的小分子蛋白,但大部分蛋白的大小處于35～70kDa之間,這與其他寄生蜂的毒液蛋白的分布比例(按分子量大小)相似,如黃腹?jié)撓壚O蜂Opiuscaricivorae的毒液中20.1～43.5kD的蛋白帶含量最高(萬(wàn)志偉等,2005),蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum和麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis(Zhangetal.,2005)以及頸雙緣姬蜂D.collaris(酈衛(wèi)弟等,2006)等寄生蜂毒液中含量較高的蛋白也處于近似的范圍內(nèi)。而且,大部分從寄生蜂毒液中分離得到的功能蛋白組分,其分子大小也集中在這個(gè)范圍內(nèi)(BeckageandGelman,2004),如黑頭折脈繭蜂Cardiochilesnigriceps毒液中含一種大小為66kDa的蛋白,可延長(zhǎng)寄主幼蟲的發(fā)育歷期(TanakaandVinson,1991);微紅絨繭蜂C.rubecula毒液中含有一種為50kDa的蛋白,則可以抑制寄主血淋巴的黑化(Asgarietal.,2003)。通過與其他寄生蜂毒液的蛋白條帶比較,推測(cè)半閉彎尾姬蜂毒液也可能含有具備調(diào)控寄主生理作用的功能蛋白。Huang等(2009,2010)研究證明,小菜蛾幼蟲體內(nèi)有延展能力的血細(xì)胞為顆粒血細(xì)胞和漿血細(xì)胞,但具有噬菌作用的血細(xì)胞只有顆粒血細(xì)胞。半閉彎尾姬蜂自然寄生小菜蛾幼蟲時(shí),在寄生后短時(shí)間內(nèi)可抑制血細(xì)胞的延展性,但當(dāng)寄生后24h,血細(xì)胞的延展能力又可得到恢復(fù)(Huangetal.,2009)。本文結(jié)果再次證實(shí)了這一結(jié)論,同時(shí)發(fā)現(xiàn)雖然在寄生后1h內(nèi)顆粒血細(xì)胞沒有延展,但其表面仍能夠粘附大量的大腸桿菌但卻未進(jìn)行進(jìn)一步的吞噬作用;寄生后24h,當(dāng)血細(xì)胞可延展時(shí),噬菌作用也可順利進(jìn)行。比較分析以上兩個(gè)現(xiàn)象,可以說(shuō)明具有噬菌功能的顆粒血細(xì)胞表面的外源物識(shí)別受體并沒有受到寄生因子的破壞,但因血細(xì)胞的細(xì)胞膜無(wú)法延展而進(jìn)行重構(gòu)內(nèi)陷,從而阻礙了噬菌過程的完成。因此,半閉彎尾姬蜂寄生通過暫時(shí)性地抑制寄主顆粒血細(xì)胞的延展性從而影響其噬菌過程。Huang等(2009)研究表明,半閉彎尾姬蜂寄生后短時(shí)間內(nèi)小菜蛾幼蟲功能血細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行包囊的主要原因之一是血細(xì)胞延展力受到抑制,而本文結(jié)果則再次證實(shí)暫時(shí)性抑制血細(xì)胞延展是半閉彎