恩施產(chǎn)野生與栽培蜘蛛香品種質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

恩施產(chǎn)野生與栽培蜘蛛香品種質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

蜘蛛香是指失敗的煎劑植物的蜘蛛香valenajatamansiya車輛管理的干燥枝條和根。性味辛、苦,溫,具有理氣和中、散寒除濕、活血消腫的功效,主要用于治療脘腹脹痛、嘔吐泄瀉、風(fēng)寒濕痹、小兒疳積、腳氣水腫、跌打損傷等癥。其化學(xué)成分主要是揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜、黃酮及其他一些成分。現(xiàn)代藥理研究表明,蜘蛛香有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、抗腫瘤等藥理作用。蜘蛛香主要分布在云南、湖北、貴州等偏遠(yuǎn)山區(qū),其中湖北恩施自治州各縣市資源豐富。隨著蜘蛛香藥用價(jià)值的日益提高,其野生資源已難以滿足市場(chǎng)需求,開展野生蜘蛛香轉(zhuǎn)家種的研究迫在眉睫,本課題組通過(guò)其根莖無(wú)性繁殖,對(duì)其野生轉(zhuǎn)家種技術(shù)進(jìn)行初步研究,培育了不同生長(zhǎng)年限的栽培品,從其產(chǎn)量及外觀性狀上觀察,二者并無(wú)較大差異,但是有關(guān)其栽培品的品質(zhì)評(píng)價(jià)尚無(wú)定論。因此,課題組分別收集不同栽培年限的蜘蛛香與野生蜘蛛香,從其性狀、鑒別、化學(xué)成分分析、指標(biāo)性成分定量測(cè)定等方面進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),以期對(duì)野生品種與栽培品種進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià),探討野生轉(zhuǎn)家種的可行性,也為蜘蛛香栽培技術(shù)的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。1試劑和樣品1.1色譜柱及色譜柱Angenlent1200高效液相色譜儀;BP121S型電子天平(北京Sartorius天平有限公司,十萬(wàn)分之一);顯微鏡(上海炳宇光學(xué)儀器有限公司),DiamonsilC-18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)。纈草三酯(純度>98%,成都植標(biāo)化純生物科技有限公司,110756-200110)、橙皮苷(純度>98%,中國(guó)藥品生物制品檢定研究院,110721-200512),乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)Fisher公司),超純水(實(shí)驗(yàn)室自制),其余試劑均為分析純。1.2未固結(jié)物的干燥實(shí)驗(yàn)用蜘蛛香藥材分別來(lái)自湖北省恩施州利川市、宣恩縣、巴東縣、咸豐縣、建始縣等5個(gè)縣市,每個(gè)縣市各有栽培品與野生1個(gè)批次,共計(jì)10個(gè)批次,野生與栽培品經(jīng)中藥鑒定教研室朱敏英教授鑒定為敗醬科植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根莖和根,來(lái)源見表1。2方法和結(jié)果2.1斷裂2.1.1蘆頭平截,葉屬單一,2本品根莖呈圓形或扁圓形,略彎曲,不分叉,長(zhǎng)3~5cm,直徑為0.5~1.6cm,棕褐色或茶褐色,表面有綢密的環(huán)紋突起,不甚規(guī)則,底面有須根痕。蘆頭平截,可見莖、葉殘基。質(zhì)堅(jiān)實(shí),斷面黃褐色。下側(cè)具多數(shù)須根,多卷縮彎曲。味略苦、辛質(zhì)堅(jiān)脆,易折斷,斷面淺綠色。2.1.2莖基殘穴分析本品根莖呈扁圓柱形,略彎曲,不分叉,長(zhǎng)2~6cm,直徑為0.6~1.7cm,莖基殘穴處稍膨大,表面褐色,表面有較綢密的環(huán)紋突起,不甚規(guī)則,底面有多數(shù)須根痕,須根多卷縮彎曲。味略苦、辛,質(zhì)堅(jiān)脆,易折斷,斷面淺綠色。栽培品種主要特點(diǎn):個(gè)頭較野生品大、顏色較淺、莖基殘穴處膨大、底面須根甚多。2.2識(shí)別標(biāo)記2.2.1圓形單紋孔結(jié)構(gòu)野生與栽培品一致。本品粉末灰褐色,置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)淀粉粒眾多,類圓形,臍點(diǎn)裂縫狀,有的可見層紋;復(fù)粒由2~4粒組成。易見含黃棕色內(nèi)含物與油滴的薄壁細(xì)胞碎片。根毛為單細(xì)胞與多細(xì)胞組成。木栓細(xì)胞淡黃色,多角形。導(dǎo)管多為網(wǎng)紋導(dǎo)管和單紋孔導(dǎo)管。薄壁細(xì)胞內(nèi)含有橙皮苷結(jié)晶和淡棕褐色物。2.2.2薄層色譜測(cè)定分別取本品野生與栽培品粉末1g,加乙醚10mL,振搖,放置5min,濾過(guò),濾液揮去乙醚,殘?jiān)蛹状?.5mL使溶解,作為供試品溶液。另取纈草三酯對(duì)照品,加甲醇制成每1mL各含1mg的對(duì)照溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn),吸取供試品溶液5μL、對(duì)照品溶液2μL,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以石油醚(30~60℃)-丙酮(5∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。野生品與栽培品顯色斑點(diǎn)沒(méi)有明顯差異。2.3綜合分析2.3.1乙腈-水萃取KromasilC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,0~20min,10%~55%乙腈,20~60min,55%~95%乙腈。體積流量0.8mL/min,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。2.3.2黃酮類化學(xué)成分見圖1。圖1中的12號(hào)峰(纈草三酯)為參照峰,野生品與栽培品化學(xué)成分比較沒(méi)有明顯差異,根據(jù)特征圖譜共有峰標(biāo)記,顯著差異峰主要集中在3、4號(hào)峰,根據(jù)極性較大的黃酮類成分與極性較小的環(huán)烯醚萜類成分主要集中在圖譜的首尾段,觀察發(fā)現(xiàn)野生品與栽培品在首尾段無(wú)顯著差異,說(shuō)明影響其藥效的主要化學(xué)成分一致,主要差異集中在中間段。2.4重量測(cè)試2.4.13草三醇的含量2.4.1.流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-水(60∶40)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為256nm。理論板數(shù)按纈草三酯峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。2.4.1.2.對(duì)照溶液的制備取纈草三酯對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1mL含纈草三酯0.1096mg的溶液,即得。2.4.1.超聲處理法分別取野生與栽培品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率500W,頻率28kHz)30min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。2.4.1.線性范圍檢測(cè)分別精密吸取纈草三酯對(duì)照品2、5、10、15、20μL注入液相色譜儀,按照2.4.1.1項(xiàng)色譜條件下檢測(cè)峰面積,同一進(jìn)樣體積連續(xù)測(cè)3次取平均峰面積,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)x,以平均峰面積為縱坐標(biāo)y進(jìn)行線性回歸,即得線性關(guān)系為y=194.09x+12.729,r=0.9996,線性范圍為0.2192~2.192μg。2.4.1.5.準(zhǔn)確度研究2.4.1.進(jìn)樣穩(wěn)定性測(cè)定將“批次1”供試品溶液室溫下放置,分別于第0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算纈草三酯色譜峰峰面積RSD值為2.40%(n=5),表明纈草三酯在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.4.1.對(duì)照品溶液的制備分別稱取6份供試品約0.5g,加入與“批次1”供試品纈草三酯含有量相當(dāng)?shù)耐粚?duì)照品溶液,分別制備6份樣品。分別測(cè)定,平均加樣回收率為100.93%,RSD為3.37%(n=6)。2.4.1.供試品溶液制備稱取不同來(lái)源的野生品與不同生長(zhǎng)年限的栽培品蜘蛛香藥材粉末各2g,按照2.4.1.3項(xiàng)下供試品制備方法制備,依次進(jìn)樣10μL,按照2.4.1.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定各供試品峰面積,外標(biāo)法計(jì)算。圖譜見圖2。2.4.2黃酮與總草三酯的體積相比2.4.2.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線準(zhǔn)確稱取橙皮苷和纈草三酯對(duì)照品適量,分別加甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為0.1106mg/mL和0.1096mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于10mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,以甲醇作空白,分別于最大吸收波長(zhǎng)284nm和256nm處測(cè)吸光度。以吸光度A對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C作圖,即得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線分別為Y=0.035x-0.006,r=0.9993,線性范圍為5.53~27.65μg/mL;Y=31.427x+0.0372,r=0.9992;線性范圍為2.19~27.4μg/mL。2.4.2.總黃酮和草三酯供試品溶液的制備分別稱取2g已脫脂和未脫脂處理的野生和栽培蜘蛛香粉末各3批次,分別加入50mL甲醇溶劑,密塞,搖勻,超聲提取1次,30min/次,取出放冷,離心分離,取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至干,加30mL甲醇溶解,濾去不溶物,濾液加甲醇定容至50mL,即得總黃酮和纈草三酯供試品溶液。分別移取0.2mL供試品溶液,加甲醇定容至10mL,以甲醇作空白,分別于284nm和256nm處測(cè)吸光度。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蜘蛛香總黃酮和纈草三酯量。2.4.2.橙皮苷和草三酯rsd的測(cè)定取橙皮苷和纈草三酯對(duì)照品適量,以甲醇作空白,分別于284nm和256nm處測(cè)吸光度,連續(xù)測(cè)定5次,計(jì)算橙皮苷和纈草三酯RSD分別為3.14%和2.89%(n=5)。2.4.2.對(duì)照品穩(wěn)定性測(cè)定將橙皮苷和纈草三酯對(duì)照品溶液室溫下放置0、2、4、6h,以甲醇作空白,分別于284nm和256nm處計(jì)算橙皮苷和纈草三酯對(duì)照品吸光度的RSD值,分別為1.98%和1.87%(n=4),表明橙皮苷和纈草三酯在6h內(nèi)穩(wěn)定。2.4.2.加樣回收及加樣回收率稱取“批次1”已知總黃酮和總纈草三酯含有量的蜘蛛香供試品6份,分別加入等量的橙皮苷和纈草三酯對(duì)照品,以甲醇作空白,分別于284nm和256nm處測(cè)吸光度,計(jì)算平均加樣回收率分別為96.31%和95.74%,RSD分別為3.34%和3.21%(n=6)。2.4.3測(cè)量結(jié)果綜上,蜘蛛香栽培品的總黃酮、纈草三酯類成分含有量均高于野生品。3指標(biāo)性成分量比野生品品質(zhì)強(qiáng)3.1野生蜘蛛香與栽培蜘蛛香的外觀性狀無(wú)明顯差異,顯微和薄層鑒別亦未發(fā)現(xiàn)明顯差異,其特征化學(xué)成分分析共有峰均存在,僅在中間段3、4號(hào)共有峰上有明顯不同,提示野生品較栽培品化學(xué)成分復(fù)雜,但是差異成分是否是其活性成分還有待商榷;野生品與栽培品的指標(biāo)性成分含有量比較發(fā)現(xiàn),總黃酮和纈草三酯量后者均高于前者。綜上,蜘蛛香栽培品品質(zhì)在指標(biāo)性成分含有量上優(yōu)于野生品。3.2蜘蛛香總黃酮是其抑菌、抗腫瘤作用的主要藥效成分,橙皮苷是蜘蛛香黃酮類的主要化學(xué)成分,利用它作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定總黃酮不僅測(cè)定準(zhǔn)確而且具有衡量其質(zhì)量的意義,已有研究表明家種蜘蛛香中橙皮苷量較野生蜘蛛香高,提示其野生轉(zhuǎn)家種的可行性。纈草三酯類成分具有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、解痙等多種藥理活性,是其主要活性成分及質(zhì)量控制指標(biāo),蜘蛛香中纈草三酯類成分量的測(cè)定方法主要有電位滴定法、比色法、酸堿滴定法。利用紫外分光光度法測(cè)定蜘蛛香中總纈草三酯量,方法準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便。蜘蛛香藥材集中九月采