高三生物2010.07.23選三1.2基因工程基本操作程序

主要內(nèi)容：（一）基因工程的概念（二）基因操作的工具（三）基因操作的基本步驟（四）基因工程的發(fā)展（五）基因工程的安全性基因工程別稱操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外和體內(nèi)基因DNA分子水平轉(zhuǎn)基因生物、基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)實(shí)質(zhì)：基因重組復(fù)習(xí)：基因工程的概念普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因構(gòu)建基因表達(dá)載體棉花細(xì)胞棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？抗蟲基因表達(dá)1234以基因工程培育“抗蟲棉”的過程為例：(含抗蟲基因)導(dǎo)入組培基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：1.獲取蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因2.抗蟲基因與運(yùn)載體DNA連接3.抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞4.檢測抗蟲基因是否導(dǎo)入、鑒定其是否表達(dá)分子手術(shù)刀——限制性內(nèi)切酶分子縫合針——DNA連接酶分子運(yùn)輸車——運(yùn)載體解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？1.1 DNA重組技術(shù)的工具1）來源：2）作用特點(diǎn)：3）功能：4）作用結(jié)果：5）舉例： 主要是原核生物中分離純化特異性識別、切割 黏性末端、或平末端1.1.1分子手術(shù)刀——限制性內(nèi)切酶

（簡稱限制酶）例：EcoRⅠ能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。識別特定序列（回文序列）、在特定位點(diǎn)切割限制酶2個黏性末端彼此間正好互補(bǔ)配對的切口要切2個切口，產(chǎn)生4個黏性末端。非編碼區(qū)非編碼區(qū)目的基因要想獲得“某個特定性狀的基因”必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？編碼區(qū)1.會出現(xiàn)相同的黏性末端如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？2.然后讓兩者的黏性末端的堿基互補(bǔ)配對，就似乎可以合成重組的DNA分子了。如果用不同的限制性內(nèi)切酶切割，還會順利形成重組DNA分子么？為什么？1.1.2 DNA連接酶——分子縫合針磷酸二酯鍵（扶手），而非氫鍵（踏板）兩個相同的黏性末端的連接、或使平末端相連形成磷酸二酯鍵用DNA連接酶連接兩個相同的黏性末端，需要連接幾個位點(diǎn)？1）連接部位：

2）結(jié)果：ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATACTATCGTACGATATTTACTTAAGCCGTATGTCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATACAGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG1）最常用載體：2）必備的條件：①②③3）其他常用種類1.1.3 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的（運(yùn)）載體

——分子運(yùn)輸車天然質(zhì)粒普遍同時具有以上三個條件嗎？目的基因運(yùn)載體同種限制酶基因表達(dá)載體受體細(xì)胞（廣東生物7）現(xiàn)有一長度為1000堿基對（by）的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000by，用Kpn1單獨(dú)酶切得到400by和600by兩種長度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同時酶切后得到200by和600by兩種長度的DNA分子。該DNA分子的酶切圖譜正確的是（）D（天津卷30）下圖為人β-珠蛋白基因與其mRNA雜交的示意圖，①～⑦表示基因的不同功能區(qū)。據(jù)圖回答：⑴上述分子雜交的原理是

；細(xì)胞中β-珠蛋白基因編碼區(qū)不能被翻譯的序列是圖中

，為該基因_____區(qū)上的_______序列。⑵細(xì)胞中β-珠蛋白基因開始轉(zhuǎn)錄時，能識別和結(jié)合①中調(diào)控序列的酶是

。⑶若一個卵原細(xì)胞的一條染色體上，β-珠蛋白基因編碼區(qū)中一個A替換成T，則由該卵原細(xì)胞產(chǎn)生的卵細(xì)胞攜帶該突變基因的概率是

。⑷上述突變基因的兩個攜帶者婚配，其后代中含該突變基因的概率是

。1.獲取目的基因2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測和鑒定1.2 基因工程的基本操作程序1）目的基因：能編碼特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。如：蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因 植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因 種子貯藏蛋白的基因 人的胰島素基因、干擾素基因……1.2.1 獲取目的基因①從基因文庫中提?、谌斯ず铣苫颍阂阎被嵝蛄泻铣苫?）目的基因的提取方法包括：基因組文庫＞cDNA文庫生物DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割得到提取mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到③利用PCR技術(shù)擴(kuò)增

目的基因用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個受體細(xì)胞中大量復(fù)制（即擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再利用一定發(fā)方法將目的基因的DNA片段分離出來。①鳥槍法（散彈射擊法）：生物體中提取出現(xiàn)成的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA(cDNA)反轉(zhuǎn)錄合成②反轉(zhuǎn)錄法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的脫氧核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成此方法合成的目的基因與真實(shí)基因一樣嗎？有何差別？只含外顯子和部分已知的非編碼區(qū)因同義密碼子有很多，所以mRNA有多種可能③人工合成目的基因法：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因概念體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。特點(diǎn)短時間擴(kuò)增目的基因。原理

DNA半保留復(fù)制原理。條件目的基因序列、引物、Taq酶、脫氧核苷酸、溫度、pH等1.2.2 基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）（1）基因表達(dá)載體的組成

目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等RNA聚合酶識別、結(jié)合的位點(diǎn)如何才能把這些序列連接在一起？（2）構(gòu)建工具：同種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶目的基因與運(yùn)載體結(jié)合的結(jié)果可能有幾種情況？目的基因與目的基因結(jié)合；運(yùn)載體與運(yùn)載體結(jié)合；目的基因與運(yùn)載體結(jié)合√思考：可以被篩選出來實(shí)質(zhì)：不同來源的基因進(jìn)行重組質(zhì)粒含目的基因的DNA分子限制性內(nèi)切酶一個切口，兩個黏性末端兩個切口，獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種（1）導(dǎo)入植物細(xì)胞（受精卵或體細(xì)胞）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法其T-DNA可將目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上1.2.3 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞經(jīng)組培，得到

轉(zhuǎn)基因植物基因槍法：

10000個整合細(xì)胞/槍 氣壓300-600米/秒

脫氧核糖核酸隨機(jī)插入，原理不明1987年，周光宇中國的轉(zhuǎn)基因棉花原理不明顯微注射法如何才能知道含有目的基因的運(yùn)載體是否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞？（2）導(dǎo)入動物細(xì)胞 ？經(jīng)胚胎移植，得到轉(zhuǎn)基因動物（受精卵為主）Ca2+處理，形成感受態(tài)細(xì)胞如何才能知道含有目的基因的運(yùn)載體是否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞？（3）導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞——繁殖快經(jīng)微生物培養(yǎng)，得到工程菌能吸收周圍環(huán)境中的DNA四環(huán)素抗性基因青霉素抗性基因如何通過檢測受體細(xì)胞中運(yùn)載體上標(biāo)記基因的表達(dá)，確定連鎖的目的基因是否導(dǎo)入？對于這個重組質(zhì)粒，該如何檢測它是否被導(dǎo)入受體細(xì)胞？目