肝功能反復(fù)異?；颊唠[匿性丙型肝炎的研究

肝功能反復(fù)異?；颊唠[匿性丙型肝炎的研究

在臨床實踐中，我經(jīng)常發(fā)現(xiàn)這樣一種患者：肝腎反復(fù)異常，肝臟保護(hù)劑治療效果不佳，病因不明確。也就是說，根據(jù)相關(guān)的病史和輔助檢查，可以提前消除肝炎病毒（hbv）、丙肝炎病毒（hcv）、甲肝炎病毒（hav）和戊肝炎病毒（hv）、酒精性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎、代謝和遺傳疾病。近年來,隱匿性HCV感染(血清抗-HCV、HCVRNA陰性,肝細(xì)胞或PBMC中HCVRNA陽性)——這一新的HCV感染狀態(tài)逐漸引起人們的重視。上世紀(jì)八、九十年代,本地區(qū)曾出現(xiàn)過大規(guī)模的有償獻(xiàn)血行為,造成本地區(qū)HCV感染呈高流行態(tài)勢,結(jié)合這一現(xiàn)象考慮隱匿性HCV感染可能是這類患者肝功能異常的主要原因之一,為此筆者對這一特殊人群進(jìn)行了研究,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。數(shù)據(jù)和方法一、一般數(shù)據(jù)(一)血藥濃度與輸血史(1)肝功能持續(xù)異常超過6個月,每3個月檢測1次,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)中至少有1項超過正常值;(2)至少有1次有償獻(xiàn)血史或在1995年前至少有1次輸血史;(3)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陰性、血清HBVDNA陰性、抗-HCV-IgM抗體陰性、血清HCVRNA陰性、抗-HAV-IgM抗體陰性、抗-HEV抗體陰性;(4)抗核抗體(ANA)、抗平滑肌抗體(SMA)、抗肝腎微粒體1型抗體(LKM-1)、抗肝細(xì)胞胞漿1型抗體(LC-1)陰性,IgG水平正常;(5)近期無藥物治療史(保肝藥物除外);(6)無長期飲酒史;(7)無靜脈吸毒史;(8)無代謝及遺傳性疾病。(二)病例組和對照組的篩選(1)在年齡、性別上與病例組相互匹配;(2)肝功能正常;(3)無輸血史、有償獻(xiàn)血史;(4)HBsAg陰性、血清HBVDNA陰性、抗-HCV抗體陰性、血清HCVRNA陰性、抗-HAV抗體陰性、抗-HEV抗體陰性;(5)ANA、SMA、抗LKM-1、抗LC-1陰性,IgG水平正常;(6)近期無藥物治療史;(7)無長期飲酒史;(8)無靜脈吸毒史;(9)無代謝及遺傳性疾病。將2010年9月至2012年8月在周口市中心醫(yī)院門診或住院就診并符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者納入病例組,共96例。篩選同期在周口市中心醫(yī)院健康服務(wù)部體檢并符合入選標(biāo)準(zhǔn)者納入對照組,共96例。本研究經(jīng)周口市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有入選者均知情同意。二、方法(一)-20預(yù)冷異丙醇的制備(1)靜脈血2mL,抽取EDTA-K2抗凝;(2)2h內(nèi)分離血漿,3000×g離心5min,以無菌吸管吸取白細(xì)胞(WBC)層,加入盛有2mL生理鹽水的無菌管中稀釋,沿管壁緩慢加入盛有2mL淋巴細(xì)胞分離液的無菌管中(所有器材預(yù)先均用DEPC水處理);(3)3000×g離心25min,以無菌吸管小心吸取單個核細(xì)胞層至一滅菌EP管中,3500×g離心4min,吸棄上清液;(4)加入0.5mL紅細(xì)胞(RBC)裂解液(5mmol/LMgCl2,1.0%TritonX-100,10mmol/LTris-HCl)溶解殘余RBC,3500×g離心4min,吸棄上清液,加50μLTE溶解沉淀;(5)另取一滅菌EP管加入150μLWBC裂解液(4mol/L硫氰酸胍,25mmol/L枸櫞酸鈉,5g/L月桂基磺酸鈉,0.1mol/Lβ-巰基乙醇),加入上述溶解的PBMC,反復(fù)吹打。然后加入-20℃預(yù)冷的氯仿50μL,顛倒混勻;(6)4℃條件下,12000×g離心10min,小心吸取上清液加入盛有100μL-20℃預(yù)冷異丙醇的EP管中,顛倒混勻;(7)4℃條件下,12000×g離心10min,棄上清液,吸水紙上吸干,加入300μL-20℃預(yù)冷的75%乙醇,輕輕混勻;(8)4℃條件下,12000×g離心10min,棄上清液,吸水紙上吸干,以無菌吸頭吸干殘液;(9)加入4μLDEPC水溶解RNA,2000×g離心5s,將管壁殘液甩至底部,冰上放置。(二)巢式pcr的預(yù)處理逆轉(zhuǎn)錄采用SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒,向新提取的核酸中加入0.5μLoligo(dT)、0.5μLdNTP(10mM)混勻,65℃放置5min,冰上冷卻至少1min,瞬離,加入1μL10×緩沖液,1μLMgCl2(20mM),1μL0.1MDTT,0.5μLRNaseOUTTMRibonucleaseinhibitor,0.5μLSuperScriptIIIReverseTranscriptase(200U/μL),最終體系為10μL,50℃反應(yīng)50min,85℃5min滅活,加0.5μLRNaseH,37℃反應(yīng)20min。反應(yīng)產(chǎn)物作為巢式PCR第一輪反應(yīng)的模板。PCR的引物序列為外側(cè)引物序列P1:5′GGCGACACTCCACCATAGATC3′(nt:18-38),P2:5′TGCACGGTCTACGAGACCTC3′(nt:339-320),內(nèi)側(cè)引物序列P3:5′CTGTGAGGAACTACT-GTCTTC3′(nt:45-65),P4:5′CCCTATCAGGC-AGTACCAC3′(nt:301-283)。第一輪PCR反應(yīng),95℃預(yù)變性1min;95℃30s,58℃30s;72℃30s,擴(kuò)增40個循環(huán);72℃,7min。第二輪PCR反應(yīng)用第一輪PCR產(chǎn)物4μL作為模板,條件同上。擴(kuò)增片段為5′端非編碼區(qū)上長度為257bp的片段。(三)凝膠電泳檢測將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)30g/L瓊脂糖凝膠電泳30min,經(jīng)凝膠自動成像顯示257bp條帶的標(biāo)本判定為PBMC中HCVRNA陽性,否則判定為陰性。(四)內(nèi)切酶酶切鑒定將陽性標(biāo)本PCR產(chǎn)物按A、B、C程序進(jìn)行酶切。3個程序均用20μL的酶切體系,包括PCR產(chǎn)物10μL,10×緩沖液TangoTM2μL,相應(yīng)內(nèi)切酶各1μL,其余用無菌水補足,37℃水浴16h。酶切產(chǎn)物經(jīng)30g/L瓊脂糖凝膠電泳30min。A操作程序用MbiI、HinfI和Bsp143II內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。B操作程序在A程序基礎(chǔ)上,應(yīng)用Bsh1236I內(nèi)切酶酶切。C操作程序在A程序基礎(chǔ)上用HaeIII內(nèi)切酶酶切,根據(jù)酶切片段判定基因型,可將1a～6a8種基因型分開。三、處理數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),兩組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,計量資料比較用t檢驗。結(jié)果一、病例組與對照組alt、ast、3gt比較兩組入選者在年齡、性別比例、體質(zhì)指數(shù)方面的差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而病例組ALT、AST、GGT均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。二、兩組vrna表達(dá)比較病例組共有54例在PBMC中檢出HCVRNA,陽性率為56.3%,明顯高于對照組2.1%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2。三、hc-內(nèi)核細(xì)胞的陽性樣本遺傳分類對56例外周血單個核細(xì)胞HCVRNA陽性標(biāo)本進(jìn)行基因分型,1b型45例,2a型11例,未檢出其他基因型。hcv感染的篩查目前,HCV感染的診斷主要依據(jù)患者血清中檢出抗-HCV或HCVRNA。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些患者血清抗-HCV和HCVRNA均為陰性,但能在其肝細(xì)胞或PBMC中檢出HCVRNA,將此類HCV感染稱為隱匿性HCV感染。診斷隱匿性HCV感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”是在肝細(xì)胞中檢出HCVRNA,但肝組織穿刺具有創(chuàng)傷性,并且費用高,不易為患者所接受。而在PBMC中檢測HCVRNA不具有創(chuàng)傷性,且費用較低,容易為患者所接受,且便于隨訪。但在PBMC中HCVRNA檢出率不及肝臟穿刺,Castillo等研究表明在肝細(xì)胞HCVRNA陽性者中,其PBMC中HCVRNA陽性檢出率在70%左右。雖然PBMC中HCVRNA陰性并不能排除隱匿性HCV感染,但其70%的檢出率作為隱匿性HCV感染的初篩試驗仍具有重要的臨床意義。本研究病例組共有54例在PBMC中檢出HCVRNA,根據(jù)這一比例推算,病例組中應(yīng)有77例隱匿性HCV感染。由此可見,隱匿性HCV感染是這類患者的主要病因。而對照組僅有2例在PBMC中檢出HCVRNA,其檢出率為2.1%,低于DeMarco等報道的歐洲健康人群檢出率3.3%。56例PBMC中HCVRNA陽性者基因分型結(jié)果顯示1b型45例(80.4%),2a型11例(19.6%),與我國血清