梨火疫病菌的檢測方法研究

梨火疫病菌的檢測方法研究

梨火病毒癥是由梨、蘋果、山楂、火荊棘和其他植物引起的最毀滅性疾病之一。病菌能夠侵染薔薇科40余屬的220多種植物。目前中國還沒有梨火疫病的發(fā)生,但梨火疫病的人為和自然傳播對中國構(gòu)成了潛在威脅,尤其是相鄰的日本國已經(jīng)有梨火疫病的分布,該病害傳入中國的風(fēng)險將會很大。準(zhǔn)確靈敏的檢測技術(shù)是阻止該病害傳入的有效手段。本研究利用梨火疫病菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株,提取脂多糖作為免疫原,免疫家兔,制備了抗血清,利用間接免疫熒光染色技術(shù)和協(xié)同凝集技術(shù)對梨火疫病菌進行了檢測。1材料和方法1.1菌株和樣品參試菌株及樣品見表1。1.2實驗材料新西蘭大耳兔,10孔免疫熒光專用玻片,普通載玻片,FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(華美公司),緩沖甘油,熒光顯微鏡等。1.3梨火病菌脂多糖的提取選取梨火疫病菌(0056菌株),參照Klement等和Barton-Wills等的方法提取梨火疫病菌的脂多糖。常規(guī)免疫家兔,最后一次免疫后10d采血,分離抗血清。1.4免疫熒光染色技術(shù)1.4.1ml-1-lm-1所有參試菌株均用無菌水制成106CFU·mL-1;接種樣品及健康枝條剪成5mm小段,每5g樣品加10mL無菌水,4℃浸泡4h,吸取浸出液備用。1.4.2羊抗兔的培養(yǎng)取樣品10μL,分別加到免疫熒光專用玻片的孔(直徑5mm)中,熱風(fēng)吹干,玻片通過火焰固定?？寡逵肞BS(0.01mol·L-1,pH7.4)稀釋1000倍,取10μL加到相應(yīng)的孔中。37℃保濕孵育30～60min。蒸餾水輕輕淋洗(避免用水直接沖洗樣品),風(fēng)干。加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(用0.01mol·L-1PBS稀釋至0.1mg·mL-1),每孔10μL。37℃保濕孵育30～60min。淋洗,風(fēng)干。加浮載液(緩沖甘油),蓋玻片封片。熒光顯微鏡觀察。記錄并照相。1.5聯(lián)合凝集技術(shù)1.5.1菌株及樣品協(xié)同凝集菌株為金黃葡萄球菌Staphylococcusaureus(CowanⅠ菌株,中國科學(xué)院微生物所提供)。參試菌株及樣品見表1。1.5.2沉淀菌體的制備將金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CowanⅠ菌株接入LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)48h,離心,棄上清,0.01mol·L-1PBS緩沖液離心洗滌3次(5000g,10min)。沉淀菌體按照1/10(W/V)用相同緩沖液懸浮(濃度為5×109CFU·mL-1),加入疊氮化鈉至0.02g·dL-1,4℃保存。取1只1.5mL離心管,加入1mL上述金黃葡萄球菌菌懸液和0.2mL制備的抗血清,37℃孵育1h,0.01mol·L-1PBS緩沖液離心洗滌3次(5000g,10min),懸浮于1mL同一緩沖液中,即為抗血清致敏的金黃葡萄球菌。1.5.3檢測法在潔凈的載玻片上滴加致敏的金黃葡萄球菌20μL,取待測菌懸液或樣品浸出液20μL,用滅菌牙簽小心混勻,3～5min后,肉眼和顯微鏡觀察并記載。2結(jié)果2.1梨火抗病性菌的免疫熒光檢測供試的梨火疫病菌所有菌株均呈陽性反應(yīng),其他菌株及健康梨樹枝條浸出液均未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞(圖1)。2.2間接免疫熒光染色利用制備的抗血清,對人工接種發(fā)病(接種后30d)樣品(枯死部位、枯死部位下0～10cm)和健康梨枝條樣品進行檢測。結(jié)果表明:所有接種樣品均呈現(xiàn)強烈陽性反應(yīng)(圖2-A,B,C),健康對照則未見發(fā)熒光的細(xì)菌細(xì)胞(圖2-D)。未經(jīng)稀釋的樣品(枯死部位下0～10cm)浸出液,由于菌體濃度過高,熒光細(xì)胞堆積重疊(圖2-A),背景熒光過強,影響觀察和照相,但不影響結(jié)果的判斷。稀釋10倍后,則見局部成團分布的發(fā)熒光的菌體(圖2-B)。病枝枯死部位可能由于死亡崩解細(xì)菌較多,可發(fā)現(xiàn)大量發(fā)熒光的細(xì)菌殘體(圖2-C)。間接免疫熒光染色方法的靈敏度為5×102CFU·mL-1。枯死部位與枯死部位下0～10cm樣品細(xì)菌含量相當(dāng),但枯死部位細(xì)菌細(xì)胞的死亡和破碎影響結(jié)果的判定。2.3梨火災(zāi)流行病原體的聯(lián)合凝集檢測2.3.1集顆粒大小++根據(jù)反應(yīng)的強弱程度,作以下劃分:液體透明,凝集顆粒粗大為“++++”,凝集顆粒較大為“+++”,凝集顆粒小為“++”;液體不透明,有凝集顆粒者為“+”,無凝集顆粒為“-”(圖3)。2.3.2凝集反應(yīng)結(jié)果將不同梨火疫病菌菌株用生理鹽水分別配制5×108,5×107,5×106,5×105,5×104和5×103CFU·mL-1菌懸液,其他參試菌株配制5×108CFU·mL-1菌懸液,分別與致敏的金黃葡萄球菌進行協(xié)同凝集。結(jié)果表明,除梨火疫病菌發(fā)生強烈凝集外,其他參試菌株反應(yīng)均為陰性。所有梨火疫病菌菌株在5×103CFU·mL-1時觀察不到凝集現(xiàn)象,表明該方法可以?；詸z測梨火疫病菌,靈敏度為5×104CFU·mL-1(表2)。人工接種和自然發(fā)病的梨火疫病樣品,其細(xì)菌濃度可達到106CFU·mL-1以上,所以該方法可以用于口岸對表現(xiàn)癥狀的苗木進行檢測。2.4枝條凝集反應(yīng)人工接種發(fā)病的梨樹枝條和健康枝條用生理鹽水制樣,制樣方法見1.4.1。結(jié)果表明,除健康樣品外,發(fā)病部位和枝條枯死部位以下不同距離的枝條均發(fā)生了明顯的凝集反應(yīng)。可能由于枝條中的某些物質(zhì)的影響,凝集圖式呈絮狀,而非典型顆粒狀(圖4)。3免疫熒光檢測本研究表明,利用梨火疫病菌脂多糖制備的抗血清所建立的間接免疫熒光染色法和協(xié)同凝集法檢測梨火疫病菌,耗時短,?；院?可在一個工作日內(nèi)完成,適合口岸對該病菌的檢測。間接免疫熒光染色法靈敏度較高(5×102CFU·mL-1),可對已經(jīng)表現(xiàn)癥狀和無癥狀的樣品進行檢測,但所需設(shè)備較昂貴;協(xié)同凝集法雖然靈敏度較低(5×104CFU·mL-1),但操作簡單,不需復(fù)雜設(shè)備,一般實驗室均可進行,并且致敏的金黃葡萄球菌經(jīng)冷凍干燥后長期保存,隨時可以進行檢測,對表現(xiàn)癥狀的樣品是一種準(zhǔn)確而簡便的檢測方法。該方法與其他血清學(xué)方法相比,具有更直觀的效果(能夠觀察到菌體形態(tài)或菌體凝集狀態(tài)),也是目前國際上檢測梨火疫病菌的經(jīng)典方法。研究結(jié)果還表明,梨火疫病發(fā)病枝條的枯死部位不是最理想的取樣和檢測部位,應(yīng)當(dāng)對病斑下0～10cm的部位取樣與檢測。Roberts曾報道,檢測梨火疫病菌的免疫熒光染色技術(shù)與一些歐文氏菌有交叉反應(yīng),經(jīng)飽和吸附后,對部分菌株的交叉反應(yīng)可完全消除,部分菌株的交叉反應(yīng)只能減弱而不能消除。本研究制備的抗血清不與其他細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。其原因可能是Robe