高等植物光合細(xì)胞的糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

高等植物光合細(xì)胞的糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

植物被視為自養(yǎng)性生物，是從整體植物的角度來(lái)看，但不同的組織、器官和分工。有些器官作為合成有機(jī)同化物的“源”,有些器官接受同化物成為“庫(kù)”。高等植物通過(guò)葉片吸收日光能,固定二氧化碳,合成蔗糖等有機(jī)同化物。然后,同化的碳在非光合器官、發(fā)育著的組織或貯藏器官之間進(jìn)行分配。葉子對(duì)同化物的貯藏能力是有限的。除了滿足自身對(duì)同化物的需求外,大部分同化物轉(zhuǎn)運(yùn)至維管組織的篩管分子(sieveelement),進(jìn)而經(jīng)長(zhǎng)距離運(yùn)輸,再?gòu)暮Y管分子進(jìn)入作為“庫(kù)”的細(xì)胞中去。一般認(rèn)為,光合同化物進(jìn)出韌皮部篩管分子是以兩種不同模式轉(zhuǎn)運(yùn)的:一種稱為共質(zhì)體模式。處在源端具光合活性的葉肉細(xì)胞與篩管分子之間通過(guò)胞間連絲組成共質(zhì)體,在庫(kù)端篩管分子又與庫(kù)細(xì)胞經(jīng)胞間連絲連接,從而同化物從源至庫(kù)可以不離開(kāi)共質(zhì)體空間,不穿越細(xì)胞質(zhì)膜。另一種模式稱為質(zhì)外體模式。葉肉細(xì)胞合成的同化物裝入或卸出韌皮部篩管分子時(shí)都必須經(jīng)由質(zhì)膜,質(zhì)膜上有特殊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter),促進(jìn)有機(jī)同化物的穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)。無(wú)論是共質(zhì)體模式還是質(zhì)外體模式都有許多實(shí)驗(yàn)根據(jù)支持。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,許多高等植物糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(包括單糖和蔗糖)的cDNA已被克隆,有力地推動(dòng)了質(zhì)外體模式研究的深入開(kāi)展。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,為了獲得高產(chǎn),不僅要設(shè)法提高光合作用形成的生物產(chǎn)量,而且要通過(guò)一定的措施來(lái)提高經(jīng)濟(jì)器官(即人們所要收獲、利用的器官)的收獲。因此,分離、鑒定高等植物糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入研究不僅具有深遠(yuǎn)的理論意義,而且對(duì)提高農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量具有重大的實(shí)踐價(jià)值。本文就植物原生質(zhì)膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。1分子克隆技術(shù)在糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的應(yīng)用細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)中存在著具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白質(zhì),其中包括泵(pump)、通道(channel)、載體(carrier)。在由通道介導(dǎo)的物質(zhì)穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)中,物質(zhì)是順化學(xué)勢(shì)或電化學(xué)勢(shì)梯度進(jìn)行易化擴(kuò)散(facilitateddiffusion),屬于被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的范疇。而由載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn),除了有被動(dòng)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程外,往往是耗能的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,即把被轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)(如糖、氨基酸等)逆電化學(xué)勢(shì)梯度的遷移與另一種分子(如H+)順電化學(xué)勢(shì)梯度的遷移相耦聯(lián),也就是說(shuō)把一個(gè)熱力學(xué)上不利的過(guò)程與一個(gè)熱力學(xué)上有利的過(guò)程連接起來(lái)。糖穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是與質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)差(ΔμΗ+)的有效自由能相聯(lián)系的,能量來(lái)自膜兩側(cè)質(zhì)子濃度差(ΔpH)和電勢(shì)差(ΔE)。而質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)差由H+-ATPase泵利用水解ATP獲得的能量生成。利用質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)差由載體促進(jìn)糖逆電化學(xué)勢(shì)梯度主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程稱為共轉(zhuǎn)運(yùn)(cotransport)。當(dāng)糖與H+一起同向越過(guò)膜時(shí),則稱為共向轉(zhuǎn)運(yùn)(symport),參與轉(zhuǎn)運(yùn)的載體蛋白稱為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。第一個(gè)編碼植物單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA(HUP1)是采用分子技術(shù)從低等單細(xì)胞的小球藻(Chlorellakessleri)中克隆出來(lái)的。像大多數(shù)生物學(xué)研究領(lǐng)域一樣,分子克隆技術(shù)在研究糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過(guò)程中發(fā)揮了獨(dú)特的作用。這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的生物化學(xué)方法難以從質(zhì)膜中分離、純化一個(gè)蛋白質(zhì),膜蛋白一般含量很少(<0.01%總蛋白),而且它只有在疏水介質(zhì)中才能保持活性,一旦與周圍疏水物質(zhì)分離,即易失去功能。此外,許多膜蛋白不是酶,不具有催化化學(xué)反應(yīng)的活性,故在分離純化過(guò)程中難以用簡(jiǎn)易方法檢測(cè),這就更增加了分離純化的難度。因此在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi),除質(zhì)子泵外,在植物質(zhì)膜中未能分離出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。自從分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展以后,許多實(shí)驗(yàn)室采用“逆”分子遺傳學(xué),即從克隆到的cDNA或基因的核苷酸序列來(lái)推測(cè)特殊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列而得到單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Hup1的cDNA克隆是利用差示篩選法從小球藻中得到的。初篩時(shí),從單糖轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)細(xì)胞制備的cDNA文庫(kù)中篩選到8個(gè)互不相關(guān)的cDNA克隆,它們都只在誘導(dǎo)的細(xì)胞中形成。對(duì)每個(gè)克隆序列測(cè)定后發(fā)現(xiàn),其中有一個(gè)cDNA克隆的序列與其它生物中已克隆的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有相當(dāng)?shù)耐葱?。然后利用這個(gè)序列尚不完整的cDNA去克隆出完整序列的cDNA。序列分析表明,這個(gè)由cDNA編碼533個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),推斷其Mr為57400,其氨基酸序列與哺乳動(dòng)物胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖載體和酵母SNF3基因有29%相同,從親水圖推斷此轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有12個(gè)跨膜區(qū)域。為了確定克隆的cDNA是己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因以及此轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于H+-己糖共轉(zhuǎn)運(yùn)的載體,Sauer等把小球藻己糖載體全長(zhǎng)的cDNA重組到裂殖酵母表達(dá)載體上,并把基因接在組成型乙醇脫氫酶啟動(dòng)子(adh)后面,用此重組DNA轉(zhuǎn)化裂殖酵母。把帶有己糖載體的酵母細(xì)胞和野生型裂殖酵母細(xì)胞置于葡萄糖類似物OMG(3-O-methyl-D-glucose)介質(zhì)中進(jìn)行各種處理。結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)化酵母中,OMG的累積超過(guò)濃度平衡點(diǎn)2~3倍,而對(duì)照酵母最多只接近濃度平衡點(diǎn),即對(duì)照酵母未能主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)OMG。當(dāng)在介質(zhì)中加入解偶聯(lián)劑時(shí),轉(zhuǎn)化酵母OMG累積立即降低并接近濃度平衡點(diǎn),而對(duì)照酵母不受影響。當(dāng)在介質(zhì)中加入乙醇作為代謝所需能量提供時(shí),轉(zhuǎn)化酵母OMG累積增加8倍,而對(duì)照酵母OMG累積沒(méi)有變化。當(dāng)在介質(zhì)中加入HCl使介質(zhì)pH從6降至4.1時(shí),轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞OMG累積立即迅速增加,而對(duì)照酵母無(wú)明顯變化。上述結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞由于帶有己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,因此當(dāng)其表達(dá)時(shí),OMG累積遠(yuǎn)高于不帶有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的對(duì)照酵母,說(shuō)明此cDNA確實(shí)是編碼己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的。此外,從加入乙醇,解耦聯(lián)劑和HCl的處理結(jié)果來(lái)看,此己糖載體是與質(zhì)子泵有關(guān)的H+-己糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體。Hup1cDNA克隆經(jīng)分離和鑒定后,這種來(lái)自低等植物小球藻的Hup1用作探針篩選高等植物的cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù),結(jié)果在擬南芥中克隆了第一個(gè)高等植物的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STP1,這為高等植物單糖穿膜運(yùn)輸研究提供了新的方法。無(wú)論是Hup1還是STP1蛋白均呈現(xiàn)出與來(lái)自哺乳動(dòng)物、酵母和細(xì)菌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有同源性,并都具有葡萄糖-H+共轉(zhuǎn)運(yùn)的特性。以后又從小球藻(HUP2)、煙草(MST1),蓖麻(HEX3)、擬南芥(STP2、STP3、STP4)中相繼克隆出單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。它們轉(zhuǎn)運(yùn)的糖類可以是葡萄糖、果糖、半乳糖等。但有些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有一定的底物專一性,如HUP2是一個(gè)半乳糖-H+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。但至今尚未發(fā)現(xiàn)可以轉(zhuǎn)運(yùn)像蔗糖或麥芽糖等雙糖的某種單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物活性植物中的蔗糖處于碳同化產(chǎn)物的中心位置,它既是光合作用碳同化的主要末端產(chǎn)物,又是同化物運(yùn)輸和分配過(guò)程中的主要轉(zhuǎn)運(yùn)形式。即使在以山梨醇、棉子糖和水蘇四糖作為同化物運(yùn)輸形式的植物中,蔗糖仍然是運(yùn)輸流的主要成分。此外,在甜菜和甘蔗中蔗糖又是主要的貯藏物質(zhì)。因此,研究同化過(guò)程中形成的蔗糖如何進(jìn)、出篩管分子,即如何穿過(guò)原生質(zhì)膜運(yùn)輸是眾所關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。第一個(gè)高等植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA是1992年由Riesmeier等克隆的。他們?nèi)∫粋€(gè)不能轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖以及不具有轉(zhuǎn)化酶活性的酵母品系,也即不能在蔗糖作為單一碳源上生長(zhǎng)的酵母品系,向這個(gè)酵母品系中引入細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶或蔗糖合成酶,使其在有蔗糖進(jìn)入細(xì)胞的可能情況下,水解蔗糖進(jìn)行生長(zhǎng)。但由于這種酵母缺乏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而不能有效地從周圍介質(zhì)中吸收蔗糖,故仍不能正常生長(zhǎng),它是一個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白虧缺的突變體。利用這種突變,在酵母表達(dá)載體中重組的菠菜cDNA文庫(kù)來(lái)轉(zhuǎn)化上述酵母突變體,通過(guò)互補(bǔ)篩選,根據(jù)在蔗糖作為唯一碳源的介質(zhì)中能否生長(zhǎng)的特性篩選出一個(gè)cDNA克隆,此克隆編碼蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoSUT1,它由525個(gè)氨基酸構(gòu)成,Mr為55000。在菠菜SoSUT1克隆后不久,Riesmeier等又采用啤酒酵母互補(bǔ)克隆的方法,從馬鈴薯中分離出蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StSUT1;Sauer等先后從擬南芥整體植株構(gòu)建的文庫(kù)中克隆了AtSUC1和AtSUC2,從大車前(Plantagomajor)的維管束構(gòu)建的文庫(kù)中篩選出PmSUC1和PmSUC2克隆。不同高等植物中已分離的H+-蔗糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有高度同源性,組成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列同源性達(dá)63%(PmSUC1與AtSUC1相比較)至77%(AtSUC1與AtSUC2相比較)。類似的同源性也存在于一些H+-單糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中,例如MST1與STP1之間為79%,STP1與STP4之間為63%。值得注意的是,雙糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列之間平均只有20%的同源性。即使是這樣,兩類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親水圖與來(lái)自細(xì)菌、哺乳動(dòng)物糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)果相一致,即所有克隆的植物糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均具有12個(gè)左右的跨膜螺旋,其N端和C端均位于質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)。為了確定已克隆的上述蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否屬于H+-蔗糖共轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,研究者們把這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中,以觀察其表達(dá)過(guò)程。例如,把菠菜SoSUT1和馬鈴薯StSUT1蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA轉(zhuǎn)化到酵母中,測(cè)定轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞對(duì)糖的吸收。結(jié)果顯示,對(duì)SoSUT1和StSUT1蔗糖吸收的Κm值分別為1.5mol·L-1和1mol·L-1,在其它測(cè)試的糖類中,只有麥芽糖對(duì)轉(zhuǎn)化有SoSUT1和StSUT1的酵母細(xì)胞吸收糖有競(jìng)爭(zhēng)作用,麥芽糖的Κm值為5和10mol·L-1。此外,經(jīng)SoSUT1和StSUT1的蔗糖吸收是與酵母細(xì)胞能量狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的,并且蔗糖的吸收被protonophores、PCMBS、焦碳酸二甲酯和苯葡萄糖苷等H+-蔗糖共轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑所抑制。SoSUT1和StSUT1介導(dǎo)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)屬H+-蔗糖共轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。此外,測(cè)定外界pH值改變時(shí)的擬南芥蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtSUC2pH值的活性,與SoSUT1、StSUT1一樣,隨外界pH降低而增加,表明StSUC2也是H+-蔗糖共轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)使大車前的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PmSUC2在一個(gè)轉(zhuǎn)化酶缺失而不能水解蔗糖的酵母品系中表達(dá)時(shí),大車前對(duì)pH依賴的PmSUC2與AtSUC2相似,且蔗糖在酵母細(xì)胞中累積達(dá)200倍以上。從表達(dá)PmSUC2酵母品系中分離出的質(zhì)膜,能與含有細(xì)胞色素C氧化酶的脂質(zhì)體膜融合,這說(shuō)明蔗糖累積是由質(zhì)子動(dòng)力(pmf)驅(qū)動(dòng)的,故而認(rèn)為PmSUC2介導(dǎo)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)也屬于H+-蔗糖共轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)。3糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)分析對(duì)分離鑒定的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行組織細(xì)胞的定位很重要,其結(jié)果可用來(lái)推測(cè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在糖運(yùn)輸中的功能。對(duì)各種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列測(cè)定結(jié)果表明,它們往往有高度同源性,但這并不意味著它們有十分相似的組織和細(xì)胞定位。例如一種人肝葡萄糖單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT7有68%的氨基酸與另一種肝葡萄糖單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2相同,但前者定位于微粒體,而后者定位于質(zhì)膜。在研究特殊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位時(shí),常采用基因工程手段,把糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的啟動(dòng)子部分與報(bào)導(dǎo)基因β-葡萄糖苷酸酶連接,并把此重組DNA轉(zhuǎn)化植物,得到轉(zhuǎn)基因植物后,分析糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在轉(zhuǎn)基因植物的不同部位中的表達(dá)。用這種方法對(duì)擬南芥4個(gè)H+-單糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)分析表明,4種蛋白均在十分專一的植物器官中呈現(xiàn)。其中,STP1在子房,STP2在花粉,STP3在綠葉葉肉細(xì)胞和花瓣,STP4在花粉和根中分別表達(dá)。從這里可以看出,STP1、STP2、STP4的表達(dá)是高度專一的,它們表達(dá)的組織是植物中屬于異養(yǎng)的非綠色部分,這些部分的生長(zhǎng)均依賴于葉子的碳源供給。Truernit等用類似的方法也分析了擬南芥SUC2基因。轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達(dá)結(jié)果指出,SUC2在除花瓣以外的所有植物部位的韌皮部中表達(dá)。這表明它能促進(jìn)同化的蔗糖從質(zhì)外體空間進(jìn)入韌皮部的伴胞或篩管分子,進(jìn)而長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)綆?kù)組織中去。此外,在一般不存在韌皮部裝載的庫(kù)組織韌皮部,如根、