外標(biāo)法測(cè)定陳皮中橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的含量

外標(biāo)法測(cè)定陳皮中橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的含量

氨基皮膚具有理氣健脾、除濕散粘液的功效。它對(duì)心血管系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、氧化和抗衰老都有一定的藥理作用。它的化學(xué)成分主要分為揮發(fā)油和黃酮類(lèi)。黃酮類(lèi)成分主要包括橙皮苷、川橙皮素、桔皮素、柚皮苷等,其中前3種黃酮類(lèi)成分在陳皮中含量較高,同時(shí)均具有較強(qiáng)的抗氧化和抗癌活性,是陳皮重要的活性成分。陳皮所含成分復(fù)雜,功效多樣,《中國(guó)藥典》2010年版一部陳皮以含量較高的橙皮苷單一成分作為檢測(cè)指標(biāo),難以體現(xiàn)陳皮多成分、多功效的特點(diǎn),且僅以單一成分控制質(zhì)量,不能較好的說(shuō)明陳皮的內(nèi)在質(zhì)量。因此,多指標(biāo)的含量測(cè)定顯得更為科學(xué)可靠。王智民提出的“一測(cè)多評(píng)”用于多指標(biāo)的測(cè)定,近年來(lái)已經(jīng)用于黃連、補(bǔ)骨脂、虎杖、干姜等中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià),其中黃連“一測(cè)多評(píng)”的含量測(cè)定方法已收入《中國(guó)藥典》2010年版,具有重要的指導(dǎo)意義。本文采用“一測(cè)多評(píng)”法實(shí)現(xiàn)陳皮多指標(biāo)的質(zhì)量控制,以橙皮苷作為指標(biāo),計(jì)算出川陳皮素、桔皮素與橙皮苷的相對(duì)校正因子,從而計(jì)算得出川陳皮素和桔皮素的含量。并采用外標(biāo)法和“一測(cè)多評(píng)”法同時(shí)測(cè)定22批陳皮樣品中3種黃酮的含量,比較其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,最終建立陳皮中3種黃酮類(lèi)物質(zhì)“一測(cè)多評(píng)”的方法。1藥物、藥品與對(duì)照品LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津),1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent),BP211DAG型電子天平(德國(guó)賽多利斯)。陳皮藥材購(gòu)于廣州省新會(huì)市多個(gè)產(chǎn)區(qū)及荷花池中藥材市場(chǎng),由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心盧先明教授鑒定為正品CitrusreticulateBlanco。橙皮苷(批號(hào)110902)、川陳皮素(批號(hào)120719)、桔皮素(批號(hào)120912)對(duì)照品均由四川省維克奇生物科技有限公司提供,3種對(duì)照品均供含量測(cè)定用,純度≥98%。乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1混合對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取橙皮苷、川陳皮素、桔皮素對(duì)照品適量,置10mL量瓶中,加甲醇溶解,即得質(zhì)量濃度分別為0.398,0.101,0.106g·L-1的混合對(duì)照品溶液。2.2超聲法制備法取陳皮粉末約0.5g,置于具塞錐形瓶中,精密加甲醇40mL,密塞,稱(chēng)定質(zhì)量,超聲(功率250W,頻率40kHz)30min,放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。2.3酸水b梯度洗脫DiamonsilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相乙腈(A)-2%乙酸水(B)梯度洗脫(0~25min,20%~40%A;25~30min,40%~50%A;30~50min,50%~60%A),流速1.0mL·min-1,柱溫25℃,檢查波長(zhǎng)283nm(橙皮苷),326nm(橙皮苷、川陳皮素、桔皮素)。該色譜條件下,各檢測(cè)組分分離度良好,見(jiàn)圖1。2.4線(xiàn)性回歸分析精密吸取2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液2,4,8,12,16,20μL,進(jìn)樣分析,以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行線(xiàn)性回歸,結(jié)果表明各成分在相應(yīng)的范圍內(nèi),線(xiàn)性關(guān)系良好,見(jiàn)表1。2.5精密度測(cè)試2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批陳皮粉末約0.5g,精密稱(chēng)定,按2.2項(xiàng)下操作,平行制備6份供試品溶液,測(cè)得橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的平均含量分別為3.97%,0.42%,0.46%,RSD分別為1.21%,1.46%,1.28%,表明重復(fù)性良好。2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)2.8加樣回收率試驗(yàn)取同一批已知含量的陳皮粉末0.5g,精密稱(chēng)定,平行6份,分別精密加入橙皮苷、川陳皮素、桔皮素對(duì)照品,按2.2項(xiàng)下制備供試液,測(cè)定,計(jì)算橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的加樣回收率,見(jiàn)表2。2.9川陳皮素、姜片和橙皮苷相對(duì)校正因子的測(cè)定精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,以326nm檢測(cè)波長(zhǎng)下所測(cè)得3種成分的峰面積計(jì)算川陳皮素、桔皮素與橙皮苷的相對(duì)校正因子,計(jì)算公式:,結(jié)果見(jiàn)表3。2.10峰定位各成分“一測(cè)多評(píng)”僅利用一種對(duì)照品作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),在沒(méi)有其他對(duì)照品的情況下,通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算多種成分的含量。因此,準(zhǔn)確地定位各成分的色譜峰是計(jì)算各成分含量的必要前提。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,可通過(guò)保留時(shí)間差和相對(duì)保留值進(jìn)行峰定位,結(jié)果見(jiàn)表4。據(jù)結(jié)果可知,兩種定位方法的RSD<3%,說(shuō)明這兩種定位方法均能準(zhǔn)確判斷川陳皮素、桔皮素色譜峰的位置。2.11相對(duì)校正因子的重復(fù)研究2.11.色譜條件進(jìn)樣測(cè)定精密吸取2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液各10μL,利用不同的液相色譜儀和色譜柱,按2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算相對(duì)校正因子,結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明不同的液相色譜儀和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子沒(méi)有顯著影響。2.11.計(jì)算流速對(duì)各相對(duì)校正因子的影響精密吸取2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液各10μL,計(jì)算流速分別為1,1.1mL·min-1時(shí)的相對(duì)校正因子,結(jié)果見(jiàn)表6。表明不同流速時(shí)對(duì)相對(duì)校正因子沒(méi)有顯著影響。2.11.計(jì)算柱溫不同30時(shí)的相對(duì)校正因子精密吸取2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液各10μL,計(jì)算柱溫分別為25,30℃時(shí)的相對(duì)校正因子,結(jié)果見(jiàn)表7。表明不同的柱溫對(duì)相對(duì)校正因子沒(méi)有顯著影響。2.12陳皮中橙皮苷、川陳皮素、瞳皮素的含量精密吸取供試品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,記錄峰面積。分別采用外標(biāo)法和“一測(cè)多評(píng)”法計(jì)算陳皮中橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的含量,結(jié)果見(jiàn)表8。據(jù)結(jié)果可知,兩種方法測(cè)得的各成分含量間沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明該“一測(cè)多評(píng)”法測(cè)定陳皮中的陳皮苷、川陳皮素、桔皮素準(zhǔn)確可靠。3精密度、穩(wěn)定性及與保留值的比較陳皮飲片的品種多樣,據(jù)以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,各品種間除橙皮苷含量差異較大外,其余兩種成分含量差異也很大。橙皮苷是陳皮中含量最高的黃酮類(lèi)成分,也是《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定的指標(biāo)檢測(cè)成分,其對(duì)照品也容易獲得,因此選其作為“一測(cè)多評(píng)”的指內(nèi)標(biāo)物。本試驗(yàn)驗(yàn)證了在不同條件下(色譜儀、色譜柱、流速、柱溫),相對(duì)校正因子均無(wú)明顯影響。采用了兩種方法定位色譜峰,試驗(yàn)結(jié)果表明,保留時(shí)間差法和相對(duì)保留值法均能準(zhǔn)確定位色譜峰,但相對(duì)保留值法應(yīng)用更為廣泛,且RSD更小,因此筆者采用相對(duì)保留值定位色譜峰。采用外標(biāo)法和“一測(cè)多評(píng)”測(cè)定了22批陳皮飲片的3種黃酮含量,結(jié)果表明兩種方法測(cè)得的含量無(wú)明顯差異,說(shuō)明該“一測(cè)多評(píng)”法準(zhǔn)確可靠。精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的峰面積,其峰面積的RSD分別為0.52%,0.67%,1.02%,表明精密度良好。精密吸取同一供試品溶液10μL,分別于0,2,4,6,8,12,24,36h進(jìn)樣,測(cè)定橙皮苷、川陳皮素、桔皮素峰面積,其峰面積的RSD分別為1.21%,1.36%,2.01%,表明供試品溶液在36h內(nèi)穩(wěn)定性良好。本實(shí)驗(yàn)中所用的陳皮飲片種類(lèi)多樣,有新鮮紺青皮、二紅皮、大紅皮及不同貯存年限的大紅皮(廣陳皮和川陳皮),從試驗(yàn)的數(shù)據(jù)初步看出陳皮的不同采收期、貯存年限以及產(chǎn)地對(duì)其成分的含量有一定影響,但由于本試驗(yàn)樣品量過(guò)少,不能說(shuō)明其具體的影響規(guī)律,該問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,陳皮中還含有少