單克隆抗體糖基化修飾研究

根據(jù)單克隆抗體的作用機(jī)制，其糖基化的位點(diǎn)、糖型種類及豐度都可能影響產(chǎn)品的有效性、安全性和質(zhì)量穩(wěn)定性，因此糖基化被普遍認(rèn)為是單抗藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）之一。多數(shù)單抗產(chǎn)品的生產(chǎn)宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系，由于生產(chǎn)工藝控制的程度不同，糖基化水平在不同廠家、不同批次之間經(jīng)常存在差異，給這類產(chǎn)品的研發(fā)和審評(píng)帶來(lái)了較大挑戰(zhàn)。研發(fā)單位應(yīng)當(dāng)在單抗產(chǎn)品早期研發(fā)階段高度重視和設(shè)計(jì)規(guī)劃糖基化修飾，建立相關(guān)檢測(cè)方法，并在工藝變更和優(yōu)化研究時(shí)密切關(guān)注糖基化及修飾水平；在產(chǎn)品臨床階段檢測(cè)積累多批次糖基化檢測(cè)數(shù)據(jù)，并在上市申報(bào)階段制訂合理、適用的控制標(biāo)準(zhǔn)；產(chǎn)品上市后開(kāi)展對(duì)糖基化水平密切監(jiān)測(cè)，以保證單抗產(chǎn)品質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定。鑒于糖基化修飾在單抗產(chǎn)品中的重要性，近年來(lái)工業(yè)界和研究機(jī)構(gòu)對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能、工藝和質(zhì)量控制進(jìn)行了大量深入的研究，本文主要對(duì)這些研究進(jìn)展作一綜述。Part1、單克隆抗體的糖基化位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)

單克隆抗體糖基化修飾多數(shù)為N-連接的聚糖。IgG型單克隆抗體一般在Fc段的Asn-297有一個(gè)保守的N糖基化位點(diǎn)，另外約20%的IgG在Fab區(qū)域存在另一個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)，這兩個(gè)糖基化位點(diǎn)都位于重鏈上。研究發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體兩條重鏈的糖基化程度多數(shù)情況下并不對(duì)稱，進(jìn)一步增加了糖基化抗體的多樣性。除N-連接的糖基化外，極少數(shù)單克隆抗體藥物中也存在O-連接的糖基化。Fc聚糖分子的核心結(jié)構(gòu)是由3個(gè)甘露糖（Man）和2個(gè)N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）分子組成的復(fù)雜“雙觸角型”五糖分子的結(jié)構(gòu)，并且不同的糖型可含有不同數(shù)量的其他分子，如巖藻糖（Fuc）、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖（Gal）、二等分N-乙酰葡糖胺和唾液酸（Sia）。糖鏈的長(zhǎng)度、分叉的方式、單糖的排列順序的差異造成了N-聚糖復(fù)雜多變的結(jié)構(gòu)。這種N-聚糖的核心結(jié)構(gòu)可通過(guò)各種酶的作用進(jìn)一步多樣化，總結(jié)起來(lái)大致可分為三種結(jié)構(gòu)，即高甘露糖型、雜合型和復(fù)合型，其中雜合型和復(fù)合型在大多數(shù)情況下均存在核心巖藻糖基化（圖1）?？贵w中常見(jiàn)的糖基化結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。單克隆抗體上的N-聚糖結(jié)構(gòu)對(duì)維持抗體構(gòu)象和穩(wěn)定性有重要的作用。Fc段的N-聚糖可以穩(wěn)定IgG抗體的CH2結(jié)構(gòu)域，去N-連接糖基化修飾的單克隆抗體熱不穩(wěn)定性加劇，其構(gòu)象更容易展開(kāi)和去折疊，更易于發(fā)生聚集。亦有報(bào)道去N-糖基化的IgG其CH2結(jié)構(gòu)域彈性增加且不可結(jié)晶。NMR分析表明G2F糖基化的單克隆抗體其Fc段末端半乳糖暴露，易與受體蛋白結(jié)合，且1,3糖苷鍵和1,6糖苷鍵兩個(gè)分支的結(jié)合能力存在差異。單抗Fc段N-聚糖可以通過(guò)CH2結(jié)構(gòu)域影響抗原和單抗分子結(jié)合產(chǎn)生的效應(yīng)功能，F(xiàn)ab段的糖基化修飾除了可能影響與抗原的結(jié)合外，也可能影響該效應(yīng)功能。Part2、單克隆抗體的糖基化相關(guān)功能

單克隆抗體與抗原分子結(jié)合后可以引發(fā)效應(yīng)功能，效應(yīng)功能由Fc段介導(dǎo)，F(xiàn)c與Fc受體或相關(guān)補(bǔ)體蛋白結(jié)合，可引發(fā)抗體依賴的細(xì)胞毒作用（ADCC）或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC）。單抗Fc段的糖基化水平可以影響ADCC和CDC，并能改變抗體的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，部分糖型結(jié)構(gòu)還能影響抗體的免疫原性。1核心巖藻糖對(duì)抗體功能的影響

ADCC由Fc與Fc-γ受體（FcγR）結(jié)合后引發(fā)，其結(jié)合力明顯受CH2結(jié)構(gòu)域中N-聚糖影響，如降低/去除核心糖結(jié)構(gòu)中的巖藻糖可以提高ADCC效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)由Lec13突變株表達(dá)的巖藻糖敲除的IgG抗體，其與FcγRIIIa結(jié)合能力提高了50倍，ADCC效應(yīng)提高了100倍?？贵wN-聚糖核心結(jié)構(gòu)中的巖藻糖是由于蛋白通過(guò)高爾基體時(shí)，在α-1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的作用下從GDP-Fuc上轉(zhuǎn)移巖藻糖基而得。采用敲除或低表達(dá)α-1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的工程細(xì)胞株，或其他途徑降低IgG抗體中的核心巖藻糖水平，可以達(dá)到提高抗體ADCC效應(yīng)的目的。

2半乳糖對(duì)抗體功能的影響末端半乳糖基對(duì)抗體效應(yīng)功能的影響目前了解得相對(duì)較少。有研究表明CDC效應(yīng)是由補(bǔ)體蛋白C1q與IgG抗體Fc段結(jié)合后引發(fā)，末端半乳糖含量增加可以提高CDC效應(yīng)。采用糖苷酶處理去除半乳糖基可以減少補(bǔ)體的溶解活性。還有研究表明末端半乳糖化可誘導(dǎo)CH2結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化，導(dǎo)致其結(jié)合的FcγR增加；高半乳糖和去巖藻糖改造的抗體其ADCC活性較未改造前增加78倍。提高的半乳糖化可能導(dǎo)致Fc段CH2結(jié)構(gòu)域之間空間距離增大，暴露出更多的氨基酸序列與FcγRⅢa結(jié)合。因此，綜合以上研究基本表明末端半乳糖可以提高CDC效應(yīng)，但目前CHO細(xì)胞表達(dá)的抗體其末端半乳糖化水平普遍較低，尚未有提高半乳糖化水平的工程細(xì)胞株報(bào)道。

3末端唾液酸對(duì)抗體功能的影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白的唾液酸修飾類型分為N-乙?；窠?jīng)氨酸（Neu5Ac，NANA）和N-羥乙基神經(jīng)氨酸（Neu5Gc，NGNA）。人體內(nèi)IgG的唾液酸類型為NANA，而NGNA型唾液酸主要存在于動(dòng)物如小鼠體內(nèi)。而采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）表達(dá)制備的單克隆抗體，經(jīng)常帶有非人的唾液酸NGNA修飾。帶有NGNA的單克隆抗體可能在人體中引發(fā)免疫原性。另外，唾液酸含量越高，IgG與Fc受體的親和力越低，從而導(dǎo)致ADCC活性降低，且與細(xì)胞表面的抗原結(jié)合減弱，其原因可能是唾液酸所占較大的空間導(dǎo)致抗體鉸鏈區(qū)彈性減小，從而降低了受體結(jié)合能力。有研究通過(guò)在表達(dá)IgG的宿主細(xì)胞中共分泌表達(dá)唾液酸酶A制備的非唾液酸化抗體，顯示出更強(qiáng)的ADCC活性。

唾液酸化水平可能影響到蛋白藥物的代謝。研究表明Fc融合蛋白的代謝受唾液酸化水平影響顯著，融合蛋白中唾液酸NANA含量越高，體內(nèi)清除速率越慢，且不受O-連接還是N-連接的影響，但NGNA類型唾液酸對(duì)蛋白的清除速率基本沒(méi)有影響。4N-乙酰葡萄糖胺對(duì)抗體功能的影響研究表明末端N-乙酰葡糖胺基（GlcNAc）可以影響CH2結(jié)構(gòu)域的熱力學(xué)穩(wěn)定性。去除GlcNAc后可以觀察到明顯的熱不穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)可溶性FcγRIIb的結(jié)合力略有降低。帶有末端GlcNAc的IgG抗體具有更長(zhǎng)的清除半衰期。帶有并表達(dá)GnTIII基因的工程細(xì)胞株其表達(dá)的抗體的雙觸角結(jié)構(gòu)中含二等分的GlcNAc，與FcγRIIIa結(jié)合能力提高，ADCC效應(yīng)增強(qiáng)，10~20倍低濃度時(shí)即可顯示殺傷效應(yīng)，這也可能是由于空間位阻導(dǎo)致的核心1,6-巖藻糖暴露減少所致。5甘露糖對(duì)抗體功能的影響高甘露糖型對(duì)Fc聚糖的異質(zhì)性程度影響較為顯著，常見(jiàn)的末端甘露糖基團(tuán)包括Man5GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2。研究表明高甘露糖型的單抗分子與C1q的親和力較低，其CDC活性也較低；與FcγRIIIa親和力則較高，相應(yīng)的顯示出了較強(qiáng)的ADCC活性，但也可能是核心巖藻糖缺失的緣故。高甘露糖型對(duì)單抗的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)影響較大，大量文獻(xiàn)報(bào)道高甘露糖型IgG分子在人血循環(huán)中具有較短的半衰期。FUT-8突變的CHO細(xì)胞生產(chǎn)的高甘露糖型和雜合型的IgG較復(fù)合型具有較高的清除速率。高甘露糖型結(jié)構(gòu)在人體中容易引起免疫原性。酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物來(lái)源的糖蛋白多為高甘露糖型，在人體中易引起高免疫原性?？贵w中帶有寡聚甘露糖的較無(wú)寡聚甘露糖的具有顯著的免疫原性。雖然多數(shù)抗體藥物中高甘露糖水平較低，但仍需密切關(guān)注產(chǎn)品可能引起免疫原性。細(xì)胞株和生產(chǎn)工藝的變化常伴隨著甘露糖含量的變化。鑒于甘露糖型對(duì)單抗產(chǎn)品的活性、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、免疫原性都具有重要影響，末端甘露糖的糖型和含量一般應(yīng)被視為單抗產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）之一。Part3、生產(chǎn)工藝對(duì)單抗產(chǎn)品糖基化的影響

鑒于聚糖結(jié)構(gòu)對(duì)抗體功能的重要影響，生產(chǎn)工藝中應(yīng)嚴(yán)格控制糖型種類、比例和含量。細(xì)胞株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)工藝都可能影響單抗產(chǎn)品的糖基化修飾水平。

1細(xì)胞株的影響

不同宿主細(xì)胞由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶配置不同，其表達(dá)的單克隆抗體的糖基化修飾一般都存在差異。單抗生產(chǎn)常用的均為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括CHO、BHK、HEK293、PER.C6等細(xì)胞，以及鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0、SP2/0、Y0等。CHO細(xì)胞是最常用的宿主細(xì)胞，主要是因?yàn)槠浠蚪M及擴(kuò)增的穩(wěn)定性較好，而且糖基化修飾穩(wěn)定且類似于人的細(xì)胞系。但CHO細(xì)胞與人細(xì)胞系表達(dá)產(chǎn)物在唾液酸與半乳糖的連接方式方面有所不同，CHO細(xì)胞缺少α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，只能產(chǎn)生α-2,3連接的唾液酸化聚糖；人細(xì)胞系則有兩種酶能產(chǎn)生α-2,3和α-2,6連接的兩種唾液酸化聚糖，且以α-2,3連接的唾液酸化聚糖為主。缺少α-2,6連接的兩種唾液酸化聚糖可能導(dǎo)致單抗分子體內(nèi)具有不同的半衰期。另外CHO細(xì)胞缺少功能性的GnTIII酶，其可以阻斷連接上二等分的GlcNAc殘基。NS0細(xì)胞則由于可以添加α-1,3半乳糖和Neu5Gc而不是Neu5Ac，導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物在人體中引起較高的免疫原性。宿主細(xì)胞對(duì)單抗的質(zhì)量有重要的影響，研發(fā)單位應(yīng)該在立項(xiàng)開(kāi)始即選擇合適的宿主細(xì)胞，如在后期進(jìn)行宿主細(xì)胞變更需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)對(duì)比研究。

2培養(yǎng)方式的影響細(xì)胞的培養(yǎng)方式可以影響糖基化的種類和水平。有研究表明，從分批培養(yǎng)變更為分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，即使補(bǔ)料成分不變，糖基化修飾有明顯不同。而培養(yǎng)方式不變，只是規(guī)模擴(kuò)大，一般不會(huì)影響糖基化水平。因此，在單抗產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，培養(yǎng)方式應(yīng)慎重變更，進(jìn)行規(guī)模擴(kuò)大時(shí)應(yīng)注意關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）的一致性。3培養(yǎng)基成分的影響

無(wú)血清培養(yǎng)基在單抗產(chǎn)品中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，然而與有血清培養(yǎng)相比，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，更易造成糖基化的多樣性和復(fù)雜性。培養(yǎng)基中的糖類等營(yíng)養(yǎng)成分作為糖基化組成的結(jié)構(gòu)片段或能量的來(lái)源，能夠顯著影響糖基化的異質(zhì)性，分批補(bǔ)料培養(yǎng)方式可以在一定程度上保持糖含量的穩(wěn)定，因此有利于糖基化水平的保持。有研究證明培養(yǎng)基中糖含量提高后，CHO等細(xì)胞表達(dá)的抗體分子中相應(yīng)的糖基化修飾和唾液酸化水平均得到提高。低糖培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞將優(yōu)先利用培養(yǎng)基中的糖滿足能量需求，分配到糖基化修飾相應(yīng)減少，分批補(bǔ)料培養(yǎng)基中去掉糖成分會(huì)導(dǎo)致了副產(chǎn)物的積累，減低了目標(biāo)產(chǎn)物的糖基化水平。Mn2+是高爾基體中β-1,4-糖基轉(zhuǎn)移酶的輔因子，無(wú)血清培養(yǎng)基中Mn2+與氨基酸成分的加入會(huì)造成更高的糖基化和唾液酸化。Mn2+自身并不足以造成最大程度的糖基化，必須與核糖類、半乳糖或尿苷類協(xié)同作用。另外有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用半乳糖等其他糖類替代培養(yǎng)基中的葡萄糖，且Mn2+含量較高時(shí)容易造成高甘露糖型修飾。其他成分方面，丁酸鈉可以通過(guò)阻斷細(xì)胞周期特異地提高抗體的產(chǎn)量，但有報(bào)道培養(yǎng)基中加入丁酸鈉可以減少半乳糖化和唾液酸化水平，增加抗體的電荷異質(zhì)性。單糖在核糖存在時(shí)可以促進(jìn)低聚糖天線形成，且核糖的存在對(duì)于糖型種類有重要影響。尿苷可以促進(jìn)核糖合成，因此單糖、核糖、尿苷都可以影響產(chǎn)品的糖基化，進(jìn)一步影響產(chǎn)品的質(zhì)量。

4培養(yǎng)溫度的影響

培養(yǎng)溫度是影響細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物質(zhì)量的重要因素之一。應(yīng)該明確的是，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)最適合的溫度不一定適合重組蛋白生產(chǎn)。較低的培養(yǎng)溫度（30~35℃）可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，具有最強(qiáng)的細(xì)胞活力和最低凋亡，表達(dá)產(chǎn)物的mRNA水平也較高。但較低溫度時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc降低，糖分支合成酶水平下降，可能造成未成熟的糖基化修飾結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。

5其他因素的影響

溶氧、pH值、游離氨、滲透壓都可以影響抗體糖基化修飾的結(jié)構(gòu)和水平。溶氧可能通過(guò)影響糖酵解途徑或重鏈間二硫鍵的形成造成空間位阻進(jìn)而影響到糖基化。氨或pH值可能通過(guò)影響細(xì)胞高爾基體內(nèi)酶活性進(jìn)而影響抗體糖基化修飾。滲透壓常與培養(yǎng)基成分、pH值等因素聯(lián)合影響糖基化水平。細(xì)胞培養(yǎng)中眾多因素都可以影響糖基化修飾，往往單因素的變化會(huì)引起多因素的協(xié)同作用，基于數(shù)理統(tǒng)計(jì)模型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）已經(jīng)用于研究細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)和原材料的變化對(duì)糖型結(jié)構(gòu)的影響。在質(zhì)量源于設(shè)計(jì)QbD理念下的生產(chǎn)過(guò)程更需要對(duì)糖基化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，通過(guò)及時(shí)中止或調(diào)整異常糖基化的產(chǎn)品生產(chǎn)將可以使生物類似藥等產(chǎn)品的工藝開(kāi)發(fā)時(shí)間大大縮短，目前這類實(shí)時(shí)分析技術(shù)正在開(kāi)發(fā)過(guò)程中。Part4、糖基化的檢測(cè)技術(shù)

蛋白糖基化中的聚糖為非模板合成，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，因此，糖基化結(jié)構(gòu)表征難度遠(yuǎn)超核酸和氨基酸序列表征，一般需要綜合生物活性方法和理化分析方法，并借助質(zhì)譜等現(xiàn)代分析儀器進(jìn)行片段分析和鑒定。生物活性測(cè)定可以通過(guò)測(cè)定受體和靶蛋白的結(jié)合或測(cè)定受體/靶蛋白結(jié)合后的生物效應(yīng)實(shí)現(xiàn)。如采用表面等離子體共振法測(cè)定抗體與其靶抗原的結(jié)合、各種Fc受體亞型的結(jié)合，基于作用機(jī)制開(kāi)發(fā)的細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因活性分析方法，細(xì)胞毒性測(cè)定方法，測(cè)定ADCC或CDC效應(yīng)等。生物活性方法雖然靈敏度低于理化分析的儀器檢測(cè)方法，但對(duì)于動(dòng)物和人體試驗(yàn)有較大的參考價(jià)值。理化分析方法采用色譜、電泳、質(zhì)譜等分析設(shè)備，一般具有比較高的靈敏度。根據(jù)測(cè)試樣品分子量大小一般分三個(gè)水平進(jìn)行，即完整抗體（top）和抗體亞單位（middle-up）、抗體片段（bottom-up）、游離寡糖。完整抗體和亞單位的水平分析中常見(jiàn)的技術(shù)包括RPLC-MS、CE/CIEF、MS（MALDI或ESI）、凝集素糖蛋白識(shí)別芯片等，一般均具有快速、方便、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，并不能提供糖基化修飾結(jié)構(gòu)的精細(xì)信息，主要用于糖型結(jié)構(gòu)的比較分析?？贵w片段水平的分析通常用胰酶等蛋白酶對(duì)抗體進(jìn)行酶解，產(chǎn)生分子量為0.5~5kD的小肽，采用色譜或電泳分離后再進(jìn)行MALDI-MS或ESI-MS分析，可以提供氨基酸序列、糖基化結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)、微小的化學(xué)和酶修飾等信息。游離寡糖的分析通常采用酶法或化學(xué)試劑法使寡糖從完整蛋白中游離出來(lái)后，借助色譜-光譜（質(zhì)譜）技術(shù)，可以對(duì)寡糖進(jìn)行定性和定量分析。近年來(lái)，隨著新材料和檢測(cè)設(shè)備的開(kāi)發(fā)，生物制品領(lǐng)域一些先進(jìn)的分析技術(shù)逐漸涌現(xiàn)出來(lái)。親水作用色譜（HILIC）采用大孔徑、2μm以下的固定相使游離聚糖、糖肽和完整糖蛋白良好分離成為可能，再聯(lián)合質(zhì)譜的HILIC-MS技術(shù)可以獲得不同糖型結(jié)構(gòu)的定量信息，以便快速比較生物類似藥與原研藥的糖基化差異。二維（2D）色譜技術(shù)選用IEX、HILIC、RPLC、SEC、HIC中兩種不同分離原理技術(shù)進(jìn)行偶聯(lián)，垂直方向上互補(bǔ)的分離技術(shù)結(jié)合在一起更易于鑒定一些未知的蛋白變異體。離子遷移色譜質(zhì)譜（IM-MS）技術(shù)根據(jù)離子形狀與電荷比實(shí)現(xiàn)分離，可以分離質(zhì)量相同而形狀不同的離子，其與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用可為研究者提供更加豐富的結(jié)構(gòu)信息，IM-MS技術(shù)已經(jīng)證明在糖基化修飾結(jié)構(gòu)、位點(diǎn)，尤其是同